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Feb 20, 2024

Microscopía de contraste de fase adaptativa para compensar el efecto menisco.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 5785 (2023) Cita este artículo 1049 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics Este artículo ha sido actualizado El contraste de fases es uno de los más importantes

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 5785 (2023) Citar este artículo

1049 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

Este artículo ha sido actualizado

El contraste de fases es uno de los métodos microscópicos más importantes para hacer visibles células transparentes y sin teñir. Los cultivos celulares suelen cultivarse en placas de microtitulación, que constan de varios pocillos cilíndricos. La tensión superficial del medio de cultivo forma una lente líquida dentro del pocillo, lo que hace que las condiciones de contraste de fase fallen en las áreas de los bordes más curvos, impidiendo la observación de las células. La microscopía adaptativa de contraste de fases es un método para aumentar considerablemente el área observable compensando ópticamente el efecto del menisco. El anillo del condensador del microscopio se reemplaza por una pantalla LCD transmisiva para permitir cambios dinámicos. En el camino de iluminación se coloca un prisma deformable lleno de líquido. El ángulo de la superficie del prisma está inclinado de forma adaptativa para refractar la luz transmitida, de modo que se pueda compensar el ángulo tangencial de la lente líquida. Además de la observación de la imagen de contraste de fase, un divisor de haz permite ver simultáneamente el anillo del condensador y el desplazamiento del anillo de fase. Los algoritmos analizan el desplazamiento para ajustar dinámicamente la pantalla LCD y el prisma para garantizar las condiciones de contraste de fase. Los experimentos muestran un aumento significativo en el área observable, especialmente para pozos de pequeño tamaño. Para placas de 96 pocillos, se puede examinar más de doce veces el área en condiciones de contraste de fase en lugar de la microscopía de contraste de fase estándar.

La microscopía de contraste de fases propuesta por primera vez en 1932 por Frits Zernike1 es un método ampliamente utilizado para observar muestras biológicas porque puede hacer visibles células transparentes y sin teñir2. Debido a la interferencia, los cambios de fase de la luz que pasa pueden hacerse visibles para aumentar el contraste en objetos semitransparentes.

Sin embargo, sus aplicaciones están limitadas por el efecto menisco, que afecta especialmente a muestras en microplacas con 96 o más pocillos3. Las mediciones de referencia han demostrado que en placas de 6 pocillos, las condiciones de contraste de fase se pueden encontrar en el 25 % (235 mm2 de 950 mm2) de la superficie del pocillo. En placas de 96 pocillos, es sólo del 2,3 % (0,84 mm2 de 36,3 mm2)4.

El contraste de fase es un método de microscopía de luz transmitida en el que se coloca un anillo de condensador en la trayectoria del haz de iluminación y la luz en el objetivo se guía a través de un anillo de fase (ver Fig. 1). Si la imagen del anillo del condensador y el anillo de fase se superponen, surgen condiciones de contraste de fase. Los cambios de fase se producen en las transiciones de la muestra observada, como en los límites de las células, que se resaltan ópticamente. Las condiciones de contraste de fase se pueden identificar fácilmente mediante el efecto "halo", que es una región con un fondo oscuro y bordes brillantes alrededor de objetos que cambian de fase2,6.

Representación esquemática del camino de iluminación en un microscopio de contraste de fases con diferentes posiciones de los pocillos. (A) Ruta de luz simplificada a través del microscopio (se han omitido elementos no activos como espejos deflectores y placas de vidrio). (1) Fuente de luz (2) Anillo del condensador (3) Lente del condensador (5) MTP (6) Lente del objetivo (7) Anillo de fase (8) Espejo móvil (9) Lente Bertrand (10) Lente ocular (11) Cámara secundaria ( 12) Lente de tubo (13) Cámara principal. Al mover el espejo (8), se puede cambiar entre el camino de luz principal (I) y el camino de luz secundario (II) para observar la superposición del anillo de fase y el anillo del condensador. (B) La luz pasa por el centro del pozo. (B.1) Imagen de superposición del anillo de fase y el anillo del condensador. Se superponen por completo. (B.2) Imagen de contraste de fases resultante del cultivo celular. (C) Debido a la curvatura de la superficie hacia el borde del pozo, el haz de luz se refracta lejos del centro. (C.1) En la imagen de superposición, es visible la desviación entre el anillo del condensador (2) y el anillo de fase (7). (C.2) La imagen celular resultante se toma en condiciones de campo claro. Las imágenes (A.2) y (B.2) se tomaron con un objetivo 10x (Nikon CFI Plan Fluor DL ​​10XF) en una MTP de 6 pocillos.

Las muestras biológicas suelen estar en un medio líquido. Una superficie líquida plana es esencial para una buena superposición del anillo del condensador y el anillo de fase, como se ve en la Fig. 1B,C. Esta superposición del anillo del condensador y el anillo de fase se puede observar a través de una unidad de lente Bertrand y una cámara secundaria.

Las células suelen cultivarse en recipientes estandarizados, como placas de microtitulación (MTP), que constan de varios pocillos. La curvatura de la superficie del medio de cultivo en cada pocillo crea una lente líquida debido a las fuerzas capilares en la pared del vaso, como se muestra en la Fig. 1. La superficie curva desvía la luz entrante y, por lo tanto, evita una superposición del anillo del condensador y el anillo de fase. El contraste de fase falla especialmente en las áreas de los bordes más curvados de esta lente, por lo que no se pueden visualizar las células en estas áreas5,6,7.

La forma exacta del menisco se puede aproximar integrando numéricamente la ecuación de Young-Laplace8. Cuanto más pequeño es el diámetro de un pozo, mayor es relativamente la influencia de las fuerzas capilares en la pared debido a la creciente relación entre la circunferencia y el área de superficie. En consecuencia, la proporción de la superficie plana del líquido en el centro del recipiente disminuye3. La mayor curvatura a lo largo de los bordes del pozo da como resultado un ángulo de refracción mayor, lo que a su vez aumenta la distorsión y los desplazamientos de la luz del anillo del condensador que evita la superposición de los anillos.

La microscopía adaptativa de contraste de fases tiene como objetivo aumentar considerablemente el área observable compensando ópticamente el efecto del menisco. El objetivo de esta configuración es aumentar el área de contraste de fase de un pozo a un valor cercano al límite físico, que está establecido por el ángulo de la superficie para la reflexión total9. La solución será un dispositivo compacto que pueda agregarse a un microscopio disponible comercialmente sin mucha preparación. Además, se utilizarán microplacas estándar en lugar de las placas especiales introducidas en “Enfoques competitivos”12. Se desea la automatización total del proceso para obtener imágenes de pozos completos sin interferencia humana. Por lo tanto, este artículo presenta un enfoque totalmente automatizado que puede incluirse en los microscopios estándar disponibles comercialmente.

Debido a la importancia de las imágenes microscópicas de contraste de fases de células en placas de microtitulación, en el pasado se han desarrollado varias soluciones que abordan el problema del efecto menisco. Esos enfoques generalmente se pueden agrupar en las siguientes categorías: prevenir la formación de un menisco, corregir ópticamente los efectos del menisco en las MTP, reducir computacionalmente el efecto en las imágenes y microscopios que compensan ópticamente el efecto del menisco. La configuración presentada en este artículo pertenece a la última categoría.

Las posibilidades para evitar que se forme el menisco van desde microplacas recubiertas hidrófobamente hasta tapas que empujan hacia abajo la superficie del disolvente para que quede plana. En lugar de modificaciones directas de la placa de microtitulación, existen insertos de plástico para su uso en pocillos estándar individuales10,11,12.

Otra aplicación son los MTP con tapas que tienen una forma tal que funcionan como un prisma y compensan así la difracción provocada por el efecto menisco. Sin embargo, esas tapas sólo funcionan para un medio celular específico con un índice de refracción definido13,14.

Además del hardware especial, también existen enfoques computacionales para la compensación del efecto de menisco, como mejorar el contraste comparando varias imágenes, por ejemplo en diferentes planos z15. Otros métodos utilizan imágenes de campo brillante, que son modificadas por algoritmos de inteligencia artificial para producir imágenes similares a las de contraste de fase16,17. Estas imágenes, sin embargo, no alcanzan la misma calidad que las imágenes reales de contraste de fase.

Finalmente, existen enfoques para compensar el efecto menisco en el camino óptico del microscopio, como el propuesto en este artículo. Una solución sugerida es deformar y desplazar de forma adaptativa un anillo de condensador virtual de acuerdo con la superficie del líquido de modo que después de pasar a través del menisco se refracte de manera que vuelva a parecerse a un anillo sin distorsionar. Para crear el anillo del condensador virtual, se utiliza una pantalla de cristal líquido (LCD)18. Este aspecto, es decir, el desplazamiento de la forma del anillo del condensador, también se presenta en este artículo. Sin embargo, el principio básico explicado en este artículo utiliza además para este fin un prisma líquido deformable. Está protegido por la patente europea EP 3 323 010 B1, propiedad de Fraunhofer Gesellschaft19.

Otro enfoque consiste en integrar un modulador de luz espacial en la trayectoria del haz en lugar de la pantalla LCD. En particular, los moduladores de luz espacial reflectante tienen una densidad de píxeles y una relación de contraste muy altas. Sin embargo, su integración es mucho más compleja, ya que el tamaño del chip suele ser mucho más pequeño que los anillos del condensador que se van a visualizar. Los moduladores espaciales transmisivos de luz también tienen una pequeña área activa, aunque existen otras posibilidades para distorsionar el anillo del condensador. También se puede utilizar un dispositivo de espejo digital en lugar de un modulador de luz espacial20.

Otro enfoque más es mover mecánicamente el anillo del condensador horizontalmente. Esto asegura el mismo alto contraste e intensidad de luz que la microscopía de contraste de fase normal. Sin embargo, es lento y requiere una mecánica compleja.

Para probar el concepto de microscopía de contraste de fase adaptativa, se construyó un demostrador que incluye los componentes principales, un anillo de condensador LCD y un prisma lleno de líquido. Luego se utilizó en experimentos para comparar la microscopía de contraste de fase regular con la adaptativa. Los detalles más importantes de la configuración se presentan a continuación.

Se insertan elementos ópticos en la trayectoria del haz de un microscopio invertido (Ti2 Eclipse, Nikon, Japón). Un adaptador de compensación reemplaza la unidad anular del condensador en la trayectoria del haz de iluminación. La Figura 2 muestra una descripción general de la configuración y el camino de luz esquemático.

Configuración de microscopio modificado y trayectoria de luz simplificada. (A) Configuración de los elementos dentro de un microscopio inverso. (a) Fuente de luz (b) Adaptador de componentes ópticos (c) MTP (d) Lente objetivo (e) Cámara principal (f) Divisor de haz (g) Lente Bertrand y cámara secundaria (B) Trayectoria de luz modificada en comparación con la presentada en Fig. 1. El anillo fijo del condensador (2) ha sido reemplazado por una pantalla LCD transmisiva. Se introduce un prisma sintonizable (4). El espejo móvil (8) se sustituye por un divisor de haz 90/10. (B.1) Principio de funcionamiento de la compensación considerando la refracción en superficies líquidas (se supone el mismo índice de refracción en prisma y medio celular).

La luz de la fuente de luz (LED100, Märzhäuser Wetzlar, Alemania) se guía a través de una pantalla LCD transmisiva (LS055R1SX04, Sharp, Japón), el condensador (ELWD, Nikon, Japón), un prisma adaptable, la muestra dentro de un MTP y el Objetivo de contraste de fase con anillo de fase integrado (aumento 4x: CFI Plan Fluor DL ​​4XF, Nikon, Japón; aumento 10x: CFI Plan Fluor DL ​​10XF, Nikon, Japón). A continuación pasa por la trayectoria del haz del cuerpo del microscopio. El espejo de desviación delante de la lente del tubo se reemplaza por un divisor de haz 90/10 (BS028—90:10, Thorlabs, EE. UU.). El 90% de la luz se guía a través de una lente ocular hasta la cámara principal (UI-3360CP-NIR-GL, IDS, Alemania) enfocando las células en la MTP. El 10% se utiliza para visualizar el anillo del condensador superpuesto y el anillo de fase a través de la unidad de lente Bertrand estándar del microscopio y una cámara secundaria (DFK 33UX265, The Imaging Source, Alemania).

El microscopio está equipado con una platina XY motorizada (SCANplus IM, Märzhäuser Wetzlar, Alemania). Dado que un pozo MTP completo no se puede cubrir con una sola imagen, se toman varias imágenes y luego se unen en una imagen según su posición21.

El adaptador de compensación presentado en la Fig. 2B.1 está compuesto por una pantalla LCD, una lente condensadora y un prisma adaptable. La pantalla LCD genera una matriz anular de condensador virtual en blanco y negro, que se puede ajustar dinámicamente en posición y forma para compensar el desplazamiento lateral \(\Delta\). El prisma adaptable lleno de líquido se inserta en la iluminación entre el condensador y la muestra para compensar el ángulo tangencial \(\varphi\) de la lente líquida.

El LCD22 puede mostrar el anillo del condensador como una matriz claro-oscuro. Permite aperturas de Ø15,5 mm y un desplazamiento del centro del anillo de 5 mm en la dirección XY.

La iluminación de fondo de la pantalla se eliminó y se reemplazó por un LED externo para lograr un mayor brillo. Esto se hizo porque el alto contraste y la alta densidad de píxeles mejoran el anillo del condensador mostrado. Se probaron dos pantallas con diferentes densidades de píxeles, 533 ppp (LS055R1SX04, Sharp, Japón) y 187 ppp (CP11009, QITA, Reino Unido). Resultó que es necesaria una mayor densidad de píxeles para una representación precisa del anillo del condensador.

El prisma adaptativo fue desarrollado específicamente para esta aplicación. Una piel elástica y dos placas de vidrio forman un volumen cerrado en el que se llenan aproximadamente 10 ml de medio líquido (Fig. 3C). Los dos vasos cilíndricos tienen un diámetro de 25,4 mm, una abertura libre de 22,86 mm y un grosor de 1 mm. Ambos están recubiertos antirreflectantes con BBAR para luz visible de 425 a 700 nm. Se eligió el agua como medio líquido por su facilidad de manipulación y compatibilidad con otros materiales. Tiene aproximadamente el mismo índice de refracción que la solución de nutrición celular (ambas n ≈ 1,333). La refracción en las superficies de las placas de vidrio (n ≈ 1,5) se desprecia debido a su pequeño espesor.

Diseño, actuación y relación geométrica de prismas. (A) Una disposición de los servos y anillos que sujetan el prisma (al revés). (B) Cinemática del prisma adaptativo. Vista desde abajo. (C) Diseño de prisma. (D) Modelo cinemático de un servorodamiento. Vista frontal. (E) Relación entre ángulos y coordenadas que describen la placa de vidrio con respecto al plano XY.

La carcasa se fabrica colando la masa de poliurea blanda y elástica GM 900-1 con un espesor de 1 mm. Después del llenado, los planos de vidrio se pegaron en su lugar para formar un sello. El material elástico permite ángulos de inclinación alrededor del punto central de la placa de vidrio inferior de hasta 30°. Debido a las relaciones cinemáticas entre el prisma y los servos, los ángulos de inclinación reales están limitados a aproximadamente 20°.

El prisma está montado en una unidad actuadora. La placa de vidrio superior se mantiene horizontal, mientras que la placa inferior se puede inclinar mediante tres servomotores. En la Fig. 3A se muestra una descripción general de la unidad, mientras que en la Fig. 3B se muestran las posiciones exactas del servomotor en relación con la placa de vidrio.

El ángulo de rotación de cada servomotor, llamado \({\gamma }_{1}\), \({\gamma }_{2}\) y \({\gamma }_{3}\), puede controlarse para moverse hasta el ángulo deseado de la placa de vidrio. El plano de la placa de vidrio inferior se expresa con los ángulos \(\alpha\) y \(\beta\), que describen la rotación alrededor del eje y y el eje x, respectivamente (representados en la Fig. 3E).

Para obtener los ángulos servo resultantes de los ángulos de la placa de vidrio, primero se debe determinar la altura de las palancas en las posiciones \({g}_{i}\) (siendo \(i\) el índice del motor). Por lo tanto, la placa de vidrio inferior del prisma se trata como un plano que puede describirse mediante la ecuación

La posición \(\left(x, y, z\right)\) describe la coordenada de un punto del plano, que está fijo en el centro del sistema de coordenadas, por lo que tiene \(\left(0, 0, 0 \right)\) como base del avión. Los valores \(a\), \(b\) y \(c\) deben derivarse de los ángulos de rotación del plano, \(\alpha\) y \(\beta\), considerados como dos ángulos en un cuboide con diagonal \(\left|v\right|=1\).

Según las leyes de los cosenos y los senos, así como el teorema de Pitágoras, se aplican tres fórmulas para poder calcular los valores de \(a\), \(b\) y \(c\). Ellos son:

Insertando las ecuaciones. (3) y (4) en (2) es igual

Los motores cambian el ángulo de inclinación de la placa de vidrio del prisma (\(\alpha\) y \(\beta\)) subiendo y bajando la palanca respectiva en los puntos de acción, que están etiquetados con \({g}_{ 1}\), \({g}_{2}\) y \({g}_{3}\), respectivamente. La distancia entre el centro del prisma y los puntos de acción, etiquetados \(r\), es de 23 mm. Las posiciones de los cojinetes de los servos con respecto a la altura de la palanca \({h}_{i}\) (ver Fig. 3D) se describen a continuación:

Insertando en el plano la Ec. (1), el desplazamiento lineal se puede calcular de la siguiente manera:

La rotación de los servomotores \({\delta }_{i}\) se convierte en una traslación vertical de las palancas \({h}_{i}\) utilizando la longitud conocida de la servopalanca \(p\) (ver servo rodamiento mostrado esquemáticamente Fig. 3D). El ángulo del servo \({\delta }_{i}\) se puede calcular usando trigonometría:

Se diseñó un adaptador compacto, que se muestra en la Fig. 4, para integrar los componentes en la trayectoria óptica del microscopio. Consta de una pantalla LCD, una lente condensadora, un prisma adaptativo y múltiples controladores. Está protegido por una carcasa impresa en 3D. Los drivers y controladores necesarios ya están integrados en el adaptador.

Adaptador de componentes ópticos. (1) Montaje del microscopio (2) Soporte de LCD (3) Controlador de LCD (4) Montura de lente de condensador (5) Controlador de motor (6) Prisma adaptable (7) Carcasa. La luz entra al adaptador desde el soporte del microscopio y sale de él después del prisma adaptable.

El adaptador está diseñado para montarse en lugar de una unidad condensadora en microscopios disponibles comercialmente. Su diseño compacto permite un amplio espacio entre este y la platina del microscopio, lo que facilita la fácil colocación de los MTP.

El proceso de adquisición de imágenes de un pozo completo fue completamente automatizado y se muestra esquemáticamente en la Fig. 5. Al principio se lleva a cabo una inicialización. Durante este proceso, la platina del microscopio se mueve hacia el centro del pozo y la pantalla LCD muestra una cruz. Luego, la cámara secundaria toma una imagen y, dado que ninguna refracción debe perturbar la luz en el centro del pozo, la cruz debe aparecer en el centro de la imagen de la cámara sin distorsiones. La posición exacta del centro de la cruz se guarda como desplazamiento \(o\) para todas las imágenes siguientes. Se utiliza una cruz como forma porque su punto central se puede determinar con mayor precisión que el anillo que se utilizará más tarde.

Diagrama de flujo del proceso de adquisición de imágenes. El proceso se puede dividir en tres partes: inicialización, adquisición y unión. La inicialización y la unión solo se realizan una vez, al principio y al final del proceso, respectivamente. El proceso de adquisición se repite para cada imagen.

Después de la inicialización, las imágenes se toman una por una. Inicialmente, el prisma se coloca verticalmente con inclinación cero. Después de mover la platina del microscopio a la siguiente posición, se muestra nuevamente una cruz en la pantalla LCD y la ubicación \(l\) de la cruz se determina como en la inicialización.

El desplazamiento \(d\) se calcula restando el desplazamiento \(o\) de la ubicación \(l\). Se puede dividir en los desplazamientos \({d}_{x}\) en la dirección x y \({d}_{y}\) en la dirección y. Los estudios empíricos han demostrado que existe una correlación lineal entre los ángulos del prisma \(\alpha ({d}_{x})\) y \(\beta ({d}_{y})\) y el desplazamiento \(d\) para todos los ángulos que puede alcanzar el actuador. Por lo tanto, los ángulos del prisma están definidos por las fórmulas.

con \({c}_{1}\) y \({c}_{2}\) determinados empíricamente. Los ángulos resultantes del servomotor \({\delta }_{i}(\alpha ,\beta )\) se calculan utilizando las ecuaciones. (1) a (12).

A continuación, el prisma se inclina en consecuencia. Si los ángulos calculados son inalcanzables (para \(\alpha , \beta >20^\circ\)), los servos se mueven a una posición neutral y no se logra el contraste de fase.

A partir de entonces, la pantalla LCD muestra un anillo de condensador con un desplazamiento que coincide con los ángulos del prisma. El desplazamiento también se determinó empíricamente para que coincida con la rotación del prisma.

Una vez establecidos los parámetros óptimos, se toma la imagen. Luego, el prisma se restablece a inclinación cero, la platina se mueve a la siguiente posición y luego se repite el proceso. Después de tomar la última imagen, todas las imágenes se unen en una imagen general.

Para validar la eficacia de la nueva tecnología, se realizaron experimentos utilizando la nueva configuración y se compararon con los resultados obtenidos utilizando microscopía de contraste de fase normal. Todas las mediciones se llevaron a cabo con el mismo microscopio, con los componentes adaptativos desactivados durante las mediciones de referencia.

Los experimentos se llevaron a cabo con placas de 6, 12, 24 y 96 pocillos. Para cada conjunto de mediciones, se ha utilizado el mismo MTP poblado por celdas. Se determinó manualmente un plano focal antes de la primera adquisición y luego se mantuvo estático durante todo el proceso. Primero se tomaron imágenes de las muestras con contraste de fase estándar y luego con el uso de componentes adaptativos. Para ambos conjuntos de imágenes, se guardaron y luego evaluaron imágenes de muestra e imágenes de lentes Bertrand, respectivamente.

Después de la adquisición, se determinó el área observable para cada imagen. Se supuso que las condiciones de contraste de fase eran aquellas en las que el fondo era más oscuro que en el borde de las imágenes y las células estaban rodeadas por un "halo", como propuso Otaki23. La relación de contraste de fase se calculó dividiendo el área de contraste de fase por el área de todo el pozo.

La diferencia en el área de contraste de fase entre los dos métodos se presenta para un MTP de 24 pocillos en la Fig. 6. Las imágenes A.2 y B.2 muestran la misma ubicación dentro del pozo utilizando diferentes métodos. Esto muestra claramente que el rango de contraste de fase aumenta aún más hacia el borde mediante el método adaptativo. Esto también lo confirma la superposición de anillos de fases en las figuras 6A.3 y B.3.

Comparación de imágenes de microscopía de contraste de fase estándar (A.1–A.3) y adaptativa (B.1–B.3) de un pocillo en un MTP de 24 pocillos, aumento de 10x. (A.1/B.1) Imágenes cosidas de todo el pozo. Las condiciones de contraste de fase están presentes en áreas con fondo oscuro. Para mayor claridad, están delineados en naranja. Las imágenes resaltadas con un cuadro verde se muestran en (A.2/B.2), respectivamente. (A.2) No se establecen condiciones de contraste de fases. (A.3) El anillo de fase y el anillo del condensador no se alinean en la posición de la imagen en (A.2). (B.2) Las condiciones de contraste de fase se aplican a toda la imagen. (B.3) El anillo de fase y el anillo del condensador se alinean en la posición de la imagen en (B.2).

Además, existe una marcada diferencia entre las condiciones de contraste de fase y las condiciones sin contraste de fase en el enfoque adaptativo. Es causado por el mecanismo de corrección que se detiene una vez que el ángulo del líquido se vuelve incorregible, por lo que se establecen condiciones de contraste de fase o se pierden por completo.

Otro indicador de las condiciones de contraste de fase que se cumplen en una imagen es la superposición del anillo del condensador y el anillo de fase. La Figura 7A.1, B.1 compara la superposición en cada imagen y la imagen de contraste de fase resultante para una placa de 96 pocillos. Las imágenes de contraste de fase correspondientes con el área observable resaltada se presentan en la Fig. 7A.2,B.2. Las imágenes de superposición muestran que la diferencia en la superposición de los anillos de fase prevalece principalmente cerca de la periferia del pozo, lo que también es visible en la imagen de contraste de fases.

Comparación de las imágenes de contraste de fases en un pocillo de un MTP de 96 pocillos, aumento de 10x. (A) Contraste de fase estándar. (B) Contraste de fase adaptativo. (A.1/B.1) Anillo del condensador y alineación del anillo de fase (A.2/B.2) Imágenes de contraste de fase. Las áreas de contraste de fase están delineadas en naranja.

De manera similar a los experimentos descritos anteriormente, el procedimiento se repitió para otras placas de pocillos. La Tabla 1 resume los resultados experimentales para todos los tamaños de pozos investigados.

El tiempo de adquisición de una imagen es de aproximadamente 5 s. El tiempo total del proceso depende de la cantidad de disparos necesarios para obtener imágenes de un pozo completo y se enumeran en la Tabla 1.

Como se muestra en la Tabla 1, el aumento relativo en el área observable es significativo para todos los tamaños de pozos examinados. Va desde casi duplicarse para placas de 6 pocillos hasta más de 12 veces para MTP de 96 pocillos. El aumento en el área observable es mayor para pozos de menor tamaño porque el área relativa que se puede visualizar con contraste de fase disminuye con el diámetro del pozo. Los pocillos más pequeños de los experimentos fueron los de placas de 96 pocillos. No está claro si la tendencia continúa para pozos aún más pequeños porque el área observable de los pozos con placas de 96 pozos ya es solo del 2,3% y es posible que no disminuya significativamente más. Además, los formatos más pequeños, como las placas de 384 pocillos, suelen utilizar pocillos rectangulares en lugar de los redondos que se ven en los formatos más grandes. Sin embargo, debido al enfoque de adaptación, se supone que las condiciones de contraste de fase también pueden mejorarse para pozos no circulares.

Como se presenta en “Enfoques competitivos”, ya existen multitud de enfoques de compensación de menisco. Sin embargo, la mayoría de ellos están diseñados para funcionar con un medio de cultivo celular específico en condiciones predefinidas. Por lo tanto, no son sólidos ante circunstancias cambiantes o con diferentes medios. Además, requieren placas de microtitulación, tapas o insertos especiales que son significativamente más caros que las placas de microtitulación estándar. Las placas de microtitulación se utilizan normalmente en grandes cantidades y están diseñadas como productos desechables, por lo que resulta ventajoso el uso de productos estándar rentables.

La microscopía adaptativa de contraste de fase ofrece un enfoque flexible para compensar el efecto de menisco que, además, funciona con hardware de laboratorio convencional. La tecnología presenta varias ventajas sobre los enfoques competidores, como lo demuestran los resultados experimentales. En concreto, permite un aumento significativo del área observable en contraste de fase. Debido a su adaptabilidad y flexibilidad, se puede utilizar con diferentes líquidos con diferentes índices de refracción. Ni siquiera requiere MTP, pero es aplicable a todos los recipientes llenos de líquido que caben en microscopios inversos. Debido a que el adaptador de contraste de fase puede instalarse simplemente en un microscopio inverso normal, la mayoría de las funciones estándar aún están disponibles y al mismo tiempo proporcionan un área observable aumentada con microscopía de contraste de fase. Además, este enfoque también ofrece una alternativa no invasiva viable a la microscopía de fluorescencia.

Estas ventajas también se aplican al enfoque de Douglas, que sólo utiliza el anillo del condensador digital18. Sin embargo, esto por sí solo no es suficiente para compensar la refracción cerca del borde, especialmente cuando el ángulo de la superficie del líquido es pronunciado. Sólo puede compensar el desplazamiento lateral de los rayos de luz \(\Delta\), pero no la rotación angular \(\varphi\).

Todas las imágenes de una serie de imágenes se tomaron siempre en el mismo plano focal. Para mejorar la agudeza, los trabajos futuros que se basen en esta tecnología deberían incorporar un mecanismo de corrección del enfoque. Sin embargo, la configuración actual fue suficiente para crear imágenes expresivas como las presentadas anteriormente.

Un inconveniente del enfoque presentado es la lenta adquisición de imágenes. Dado que un número cada vez mayor de laboratorios se automatizan y requieren un mayor rendimiento, es necesario un proceso de adquisición rápido24. Un enfoque para acelerar el proceso de contraste de fase adaptativo sería adquirir imágenes durante el movimiento de la muestra, lo que ya se ha demostrado para la microscopía de contraste de fase regular25. Está previsto evaluar este enfoque en un futuro proyecto de investigación.

La microscopía de contraste de fase adaptativa permite aumentar significativamente el área en la que es aplicable la microscopía de contraste de fase. Se realizaron estudios cuantificables utilizando placas de microtitulación. El área observable se midió y se comparó con la microscopía de contraste de fases convencional. En todos los casos se mostró un aumento significativo en el área observable, con un efecto mayor en los pozos más pequeños debido a un efecto de menisco más pronunciado. Para placas de 96 pocillos, el área utilizable aumenta más de 12 veces, de aproximadamente el 2,3 % del área total de los pocillos a aproximadamente el 28 %, lo que hace que la microscopía de contraste de fases sea una opción viable para el escaneo no invasivo de cultivos celulares.

Además, la solución se puede automatizar completamente para que sea posible la integración en un proceso automático. A diferencia de otros métodos para compensar el efecto menisco, no se requiere ningún equipo de laboratorio especial, pero se pueden utilizar microplacas estándar.

Por estas razones, el enfoque presentado tiene el potencial de ampliar enormemente el área de aplicación de la microscopía de contraste de fase, especialmente si se puede reducir el tiempo de obtención de imágenes.

Los autores confirman que los datos de imágenes que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo. El dispositivo experimental se construyó en el Fraunhofer IPT y se describe en el artículo. El software de control es propiedad intelectual de Fraunhofer-Gesellschaft y, por tanto, no es apto para publicación.

La versión original en línea de este artículo fue revisada: en la versión original de este artículo, el correo electrónico de Florian Nienhaus era incorrecto. El correo electrónico correcto de Florian Nienhaus es [email protected].

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Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. El proyecto IGF "APERITIf" número 19083 N de la Asociación de Investigación en Mecánica de Precisión, Óptica y Tecnología Médica (Forschungsvereinigung Feinmechanik, Optik und Medizintechnik e. V.—FOM) fue financiado por el Ministerio Federal de Economía en el marco del programa de la promoción de la investigación industrial conjunta (IGF) llevada a cabo por el AiF en base a una resolución del Bundestag alemán.

Instituto Fraunhofer de Tecnología de Producción IPT, Aquisgrán, Alemania

Florian Nienhaus, Tobias Piotrowski, Bastian Nießing, Niels König y Robert H. Schmitt

WZL | Universidad RWTH Aachen, Aquisgrán, Alemania

Robert H. Schmitt

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FN se comprometió con todas las partes del estudio y el artículo. TP diseñó el estudio y se comprometió con todas las partes del documento. BN, NK y RS supervisaron y agregaron la importancia del cultivo y la automatización de células. Todos los autores han revisado y revisado el artículo.

Correspondencia a Florian Nienhaus.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Nienhaus, F., Piotrowski, T., Nießing, B. et al. Microscopía de contraste de fase adaptativa para compensar el efecto menisco. Representante científico 13, 5785 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32917-6

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Recibido: 08 de diciembre de 2022

Aceptado: 04 de abril de 2023

Publicado: 08 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32917-6

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