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Jun 28, 2023

Comparación de tecnologías alternativas de purificación de vectores virales

Por Jack Vicalvi, científico principal, J2 Biopharm Associates LLC Esta es una descripción general de productos y enfoques innovadores seleccionados desarrollados durante los últimos 15 años que han contribuido a

Por Jack Vicalvi, científico principal, J2 Biopharm Associates LLC

Esta es una descripción general de productos y enfoques innovadores seleccionados desarrollados durante los últimos 15 años que han contribuido a mejoras que permiten la fabricación de terapias de vectores virales con mayores recuperaciones y purezas.

Esta es la segunda parte de una serie que analiza algunos avances específicos de la tecnología de purificación. La primera parte analizó los equipos y procesos posteriores para los anticuerpos monoclonales.

En la segunda parte, examinamos cómo estos productos pueden cambiar la forma en que fabricamos dichas terapias con vectores virales, dónde se pueden utilizar en los esquemas de desarrollo de procesos actuales y qué ventajas confieren sobre los métodos anteriores. Abordamos la economía situacional que impulsa el uso de estos productos o enfoques innovadores. Finalmente, nos centramos en los modelos de ampliación de GMP con fines prácticos: si no se escala según GMP, no importa qué tan bien funcione en el desarrollo.

Diagramas de flujo de procesos de vectores virales

La clarificación de las cosechas de vectores virales es más complicada que la clarificación de mAb. La clarificación tradicional suele comenzar con una centrifugación diferencial o en gradiente. Esto puede ser, en el mejor de los casos, problemático para la fabricación GMP a escalas superiores a 100 L, ya que el tamaño de carga del lote del cubo de la centrífuga es generalmente pequeño (10 a 20 L); luego están las preocupaciones sobre la generación de aerosoles, la limpieza y la validación, así como los costos de bienes de capital que pueden ser obstáculos. Incluso con un paso de centrifugación, la filtración profunda y la filtración estéril siguen siendo necesarias. El uso de filtros de profundidad cargados puede ser insostenible dependiendo del virus, ya que la mayoría de los virus están unidos por fracciones de carga aniónica. Sin embargo, en presencia de NaCl de 200 a 300 mM, muchos virus no serán eliminados por dichos dispositivos, mientras que parte del HCP y del ADN de la célula huésped todavía están unidos.

Los virus envueltos, como los lentivirus y los alfavirus, son más lábiles y es posible que no les vaya bien con la filtración profunda. Sin embargo, los alfavirus son más robustos y pueden ser susceptibles a una filtración profunda normal, e incluso cargada. En estos casos, utilizamos Pall SupraCap 100 (4 a 2,1 µm), Pall HCDII (1,2 µm) y AcroPak 500 (0,8 a 0,45 µm) en serie. También se pueden utilizar las membranas Millipore DOHC, COHC y XOHC. El uso de filtros de 0,2 µm suele provocar pérdidas importantes y debe evitarse hasta la filtración final. Es imperativo mantener un sistema cerrado aséptico durante el procesamiento.

Los virus sin envoltura más populares, como los adenovirus (AV) y los virus adenoasociados (AAV), se pueden clarificar utilizando filtros de profundidad cargados de 3M en presencia de NaCl de 180 a 250 mM. Utilizamos los filtros 05SP (10 a 2 µm) y 60SP (3 a 0,2 µm) en serie para alfavirus sin envoltura y algunos con envoltura.

El método tradicional de captura de vectores virales es AIEX. Esto se puede lograr usando resinas o membranas. Para los virus envueltos, el método de membrana suele ser mejor, ya que es mucho más suave para el virus que el tortuoso camino a través de una columna empaquetada. Los dispositivos más comunes empleados incluyen el Pall Mustang Q, Sartorius Sartobind Q-STIC y el monolito BIA CIMultus. El mayor inconveniente de las membranas o monolitos es su baja capacidad, lo que provoca la necesidad de utilizar múltiples ciclos. Sin embargo, el uso de una columna con una altura de lecho corta (6 a 10 cm) también puede funcionar, con el beneficio adicional de una capacidad significativamente mayor que las membranas. Los virus no envueltos de uso común pueden capturarse mediante dispositivos de resina o de membrana.

Un método alternativo es utilizar cromatografía de afinidad. Muchos virus tienen sitios de unión a heparina en su superficie, incluidos los virus con envoltura. Hemos tenido éxito con Heparin HyperD como paso de captura para un alfavirus después de la digestión y clarificación con nucleasa M-SAN, lo que resultó en una recuperación >90 % con una excelente eliminación de hcDNA y una reducción significativa de HCP mientras se ejecuta la columna a 450 cm/h. Las resinas cerámicas HyperD son operativamente similares a las resinas de poliestireno. Existen otros protocolos de purificación que han incorporado Cellufine Sulfate o Capto DeVirS como paso inicial de captura; Estas resinas han funcionado bien en la purificación de flavivirus.

Tabla 1.Comparación de captura de vectores virales (AIEX) de resinas blandas, rígidas y membranas

*Q Sepharose @ $6000/L = $60 000/columna x 2 (respaldo GMP) = $120 000 + columnas ($40 000-$60 000 cada una).**POROS HQ @ $7500/L = $75 000/columna x 2 (respaldo GMP) = $150 000 + columnas ($40,000-$60,000 cada una).***Mustang Q XT @ $18,000 cada una x 2 (respaldo GMP) = $36,000.

En muchos enfoques tradicionales para virus sin envoltura es posible que no existan pasos de pulido. Sin embargo, podría ser aconsejable disponer de algo para eliminar parte del HCP restante. Las opciones pueden incluir CIEX, HIC, SEC o modal mixto. El modal mixto puede incorporar los tres, dependiendo del tamaño de poro de la resina seleccionada. Si se selecciona CIEX, tenga en cuenta que un pH cercano o inferior al IP del virus puede inactivarlo; recuperarás una gran cantidad de virus, pero no será infectivo. Capto Core 700 tiene una fracción aniónica en un brazo hidrófobo largo adherido a agarosa con tamaños de poro que excluyen la difusión viral. En presencia de sal (p. ej., de una etapa de captura y elución), el virus no se une al AIEX; sin embargo, el ADNhc está unido y el HCP está unido al resto hidrofóbico. Capto MMC tiene un resto catiónico en un brazo hidrófobo largo unido a agarosa reticulada que puede usarse en una operación de flujo continuo.

Por el contrario, los virus envueltos no se comportan bien con resinas basadas en HIC; sus membranas son muy hidrófobas y no se liberan fácilmente en condiciones normales de funcionamiento. La mayoría de los virus envueltos también tienden a unirse a muchas resinas CIEX en condiciones normales de funcionamiento. Un enfoque alternativo es emplear una resina o membrana AIEX después de la captura por afinidad como paso de pulido principal.

El enfoque SEC es otra alternativa, que permite que el virus pase en el volumen de exclusión mientras atrapa al HCP y fragmentos contaminantes más pequeños en la matriz. BioWorks tiene una resina SEC que funciona bien a alta capacidad (20 % del volumen de resina) y a una velocidad razonable para dichas resinas (120 a 180 cm/h), mientras que la mayoría de las resinas SEC funcionan mejor con una carga del 3 % al 10 % de resina. volumen y una velocidad lineal de 20 a 60 cm/h.

Tanto en los métodos tradicionales como en los alternativos, este paso generalmente se omite. Sin embargo, si los niveles de HCP o las proporciones de cápside vacía/llena siguen siendo superiores a lo deseado después de seguir los pasos de captura y pulido modal mixto, puede ser apropiado un paso de pulido adicional con una resina SEC como se describe anteriormente. Alternativamente, una ultracentrífuga rotatoria automatizada escalable desarrollada recientemente por Alfa Wasserman puede ser útil en este paso para eliminar los contaminantes de las células huésped, así como las cápsides vacías o parcialmente llenas.

Muchos métodos intentan utilizar el paso TFF como medio para reducir HCP y hcDNA. Generalmente, esto rara vez funciona ya que estos contaminantes, si todavía están presentes, probablemente estén asociados con la molécula objetivo mediante interacciones iónicas o hidrofóbicas. Además, las membranas herméticas de 10 a 30 kD simplemente no tienen tamaños de poro que sean lo suficientemente grandes como para permitir el paso de la mayoría de los HCP (30 a 60 kD). Si bien la mayoría de los virus pesan mucho más de 300 kD, son maleables y pueden atravesar estas membranas en condiciones normales de funcionamiento (10 a 15 psi). En la mayoría de las circunstancias, las membranas de 100 kD funcionan mejor, aunque los AAV pueden requerir una membrana de 50 a 70 kD para una recuperación máxima.

La principal diferencia entre la purificación de mAb y la purificación de virus es la eliminación viral. Los métodos utilizados para la eliminación viral en procesos de mAb (distintos de la filtración) son los métodos utilizados para la purificación de virus. Los principios de la cromatografía siguen siendo los mismos: utilizar diferencias de carga (debidas al pH y la conductividad), el peso molecular, la hidrofobicidad y tal vez la afinidad del ligando.

La clarificación también es similar, ya que la cosecha está cargada de enzimas proteolíticas y restos celulares al igual que en la producción de mAb, y estos contaminantes deben eliminarse lo antes posible. Lo importante es comenzar el proceso con la mejor oportunidad no solo de capturar la molécula objetivo sino también de eliminar tantos contaminantes como sea posible.

La elección de columnas, resinas y membranas para la purificación de vectores virales plantea las mismas preocupaciones que con la purificación de mAb. Repligen ofrece columnas desechables preempaquetadas Opus que van desde 50 µL hasta 150 L (80 cm de diámetro). Se pueden empaquetar con más de 300 resinas especificadas por el usuario en una gama de alturas de lecho de 0,25 a 30 cm. Alternativamente, las columnas Sepragen Radial Flow Superflo operan de cuatro a 10 veces más rápido a una presión operativa más baja con volúmenes de piscina más bajos que las columnas axiales convencionales, lo que permite una reducción significativa en los costos de purificación. Estas columnas también están disponibles en un formato preempaquetado con cualquier resina. Lo interesante de las columnas de flujo radial es que la altura del lecho suele ser de 5 a 7 cm y el aumento de escala se logra aumentando la longitud del tubo, de manera similar a un enfoque de fibra hueca. Esta disposición podría ser más beneficiosa para la purificación de virus con envoltura lábil.

Las resinas rígidas pueden funcionar a altas velocidades lineales (800 a 1200 cm/h) sin una pérdida significativa de productividad. Alternativamente, Pall Danaher está comercializando una plataforma de cromatografía basada en fibra obtenida mediante la adquisición de Puridify (de Cytiva). El formato de fibra tiene una estructura de poros abiertos que permite el transporte de masa por convección, lo que genera capacidades de unión independientes del caudal y tiempos de ciclo de minutos en comparación con las horas de la cromatografía de resina tradicional. Estas membranas y fibras se pueden usar para ciclos rápidos en un solo lote antes de su eliminación, y las áreas de superficie más grandes y las estructuras microporosas también pueden hacer que estas tecnologías de fibras sean adecuadas para la purificación de vectores virales.

En el caso de los virus sin envoltura, la captura con resina AIEX es el método más popular. Sin embargo, una resina de afinidad permite una mayor reducción de HCP y hcDNA como flujo continuo, mientras que AIEX se unirá a HCP y hcDNA. Para AIEX, se pueden utilizar lavados selectivos de tampón para reducir algo de HCP y eliminar las cápsides vacías antes de la elución; El ADNhc tiende a unirse más estrechamente que la mayoría de los HCP, lo que requiere lavados con mayor cantidad de sal y/o NaOH para eliminarlo de la resina. Como se mencionó anteriormente, la elección de la composición de la matriz también contribuye a la eliminación o retención de contaminantes y puede eliminar o aumentar la necesidad de una purificación adicional aguas abajo de cualquier paso.

Al igual que con los mAb, el orden que sigue al paso de captura de los vectores virales debe estar dictado por las condiciones de elución del paso anterior. Reducir la manipulación de buffers entre pasos evita pasos TFF innecesarios. Es posible que se requieran algunas diluciones simples de tampón para alterar la conductividad o el pH del paso de elución anterior y, cuando sea posible, deben manipularse en tanques de mezcla, especialmente para los pasos de unión-elución. Los pasos de flujo generalmente se reservan para el último paso antes del TFF, ya que tienden a aumentar el volumen de la sustancia farmacológica. El uso de membranas en lugar de resinas en los pasos de flujo ayuda a reducir el aumento de volumen resultante y acortar el paso de concentración de TFF.

Elegir el límite molecular apropiado para la membrana TFF es fundamental. Los vectores virales tienen un tamaño más variable que los mAb; sin embargo, siempre son mucho más grandes que los mAb y también pueden cambiar de forma bajo presión y atravesar poros de más de 100 kD. Hemos encontrado partículas de alfavirus envueltas (90 a 100 nm) en el diafiltrado de membranas de 300 kD en condiciones normales de funcionamiento (10 a 15 psi), pero no en el diafiltrado de membranas de 100 kD. Los virus más pequeños, como el AAV, requerirán tamaños de poro más estrechos (30 a 70 kD), lo que hace que la eliminación del HCP en una etapa más temprana del proceso sea más imperativa.

Por último, los factores clave en cualquier estrategia de purificación son el costo y la productividad. Considere siempre los costos de fabricación al diseñar su método. Aumentos relativamente pequeños en los costos durante el desarrollo del proceso pueden resultar en una mayor productividad y ahorros de costos durante la fabricación cuando se eligen sabiamente. Siempre que seleccione un paso en particular (resina o membrana), considere siempre el costo de fabricación GMP (validación, tiempo de suite, consumo de buffer, etc.). Además, deje que sus atributos críticos de calidad impulsen el desarrollo del proceso; Seguir el camino más fácil o más económico desde el principio puede volverse perjudicial para usted en la fabricación.

Referencias:

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Sobre el Autor

Jack Vicalvi es científico principal y director de desarrollo de procesos posteriores en J2 Biopharm Associates, una firma consultora, donde asesora a compañías biofarmacéuticas sobre procesos de fabricación GMP y brinda soporte para presentaciones regulatorias. Antes de eso, trabajó para Pall Life Sciences como científico principal y gerente de desarrollo de procesos posteriores. Anteriormente, sus puestos incluyeron puestos de liderazgo e investigación en Goodwin Biotechnology, Xcellerex, Exact Labs, Catalent y Sunovion Pharmaceuticals. Realizó sus estudios universitarios en St. Anselm College, seguidos de programas de posgrado en inmunología en la Southern Illinois University y parasitología en Vanderbilt. Conéctese con él en LinkedIn.

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