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Jun 09, 2024

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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 3625 (2023) Citar este artículo 738 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics La investigación basada en biochips está evolucionando actualmente hacia una tecnología tridimensional y

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 3625 (2023) Citar este artículo

738 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

La investigación basada en biochips está evolucionando actualmente hacia una base tridimensional y a gran escala similar al microambiente in vivo. Para obtener imágenes en vivo y de alta resolución a largo plazo de estas muestras, la microscopía no lineal capaz de obtener imágenes sin etiquetas y a múltiples escalas es cada vez más importante. La combinación con imágenes de contraste no destructivas será útil para localizar eficazmente regiones de interés (ROI) en muestras grandes y, en consecuencia, minimizar el fotodaño. En este estudio, una microscopía de coherencia óptica fototérmica (OCM) sin etiquetas sirve como un nuevo enfoque para localizar el retorno de la inversión deseado dentro de muestras biológicas que están bajo investigación mediante microscopía multifotónica (MPM). La débil perturbación fototérmica en la muestra por el láser MPM con potencia reducida se detectó en las partículas fototérmicas endógenas dentro del ROI utilizando el OCM fototérmico de fase diferenciada (PD-PT) altamente sensible. Al monitorear el cambio temporal de la señal de respuesta fototérmica del OCM PD-PT, el punto de acceso generado dentro de la muestra enfocada por el láser MPM se ubicó en el ROI. Combinado con el movimiento automatizado de la muestra en el eje x-y, el plano focal de MPM podría navegarse de manera efectiva hasta la porción deseada de una muestra volumétrica para obtener imágenes de MPM específicas de alta resolución. Demostramos la viabilidad del método propuesto en microscopía de segunda generación armónica utilizando dos muestras fantasma y una muestra biológica, un insecto fijado en un portaobjetos de microscopio, con dimensiones de 4 mm de ancho, 4 mm de largo y 1 mm de espesor.

La microscopía multifotónica (MPM) permite análisis de alta resolución en diversos campos de investigación biológica. En los últimos años, el uso de MPM ha seguido ganando atractivo en la imagen biomédica, especialmente en áreas de la imagen de neuronas profundas in vivo y vivas en pequeños animales1,2,3,4,5, la detección temprana de tumores y su caracterización6,7, 8,9, red vascular e imágenes de organoides en su microambiente en biochips10,11,12. Ha habido muchos enfoques para aumentar la profundidad de la imagen, un mayor campo de visión (FOV) y acortar el tiempo de escaneo volumétrico mediante la adopción de fluoróforos apropiados13, óptica adaptativa14, mecanismos multihaz y multifocal15,16, además de otras modificaciones similares. en la configuración óptica que ha dado variaciones de los sistemas de imágenes MPM que se pueden adoptar según las necesidades de imágenes y los escenarios de aplicación 5,16,17,18,19,20,21.

El fotodaño y el fotoblanqueo son factores críticos a considerar en las imágenes multifotónicas. La iluminación prolongada acompañada de una alta potencia láser necesaria para obtener imágenes multifotónicas sin etiquetas, genera un fotomecanismo de daño tisular que produce una fluorescencia mejorada que causa la muerte celular, lo que se conoce ampliamente como fotodaño 22,23,24. Para evitar la aparición de fotodaño en células vivas, se debe tener cuidado de garantizar que los parámetros de imagen estén muy por debajo del umbral de fotodaño, como la intensidad máxima, la tasa de repetición y los tiempos de exposición prolongada (permanencia)24. La mayoría de estos parámetros pueden ser controlados por los sistemas de fuente y detección. Múltiples grupos de investigación estudiaron y propusieron varios enfoques para suprimir los efectos del fotoblanqueo y el fotodaño. El método más simple y más ampliamente adoptado es reducir la potencia de iluminación total de una fuente de luz4,25,26. Sin embargo, esto, a su vez, reduce la sensibilidad general del sistema debido a la reducida relación señal-ruido. Los enfoques alternativos reportados para mitigar este efecto implican un método de exposición a la luz controlada que controla espacialmente la luz expuesta a la muestra, el uso de un divisor de pulso pasivo que redistribuye el pulso del láser de iluminación en subpulsos con energías iguales y un escaneo óptico rápido. Mecanismo que reduce el fotodaño al controlar la iluminación y la recolección de emisiones de los especímenes27,28,29,30. Además, utilizando el método de iluminación con lámina de luz, sólo se ilumina eficazmente el plano focal del objetivo de detección31. Aunque estos métodos son útiles para reducir los efectos del fotodaño y el fotoblanqueo, se requiere una iluminación de alta potencia a largo plazo cuando se busca la región de interés (ROI) en muestras grandes con FOV pequeños y tiempos de escaneo volumétrico prolongados, lo que resulta en fotodaño y fotoblanqueo.

En las últimas décadas, múltiples grupos de investigación informaron las ventajas de incorporar tanto la MPM como la tomografía de coherencia óptica (OCT) como una única plataforma de imágenes multimodal, donde sus ventajas compensan las limitaciones de las demás modalidades32,33,34,35. En particular, las técnicas de imágenes MPM y OCT tienen diferentes características en términos de resolución, FOV, profundidad de imagen y velocidad de imagen. Por ejemplo, MPM utiliza un mecanismo no lineal que requiere un volumen estrechamente enfocado del rayo láser en la muestra con un objetivo de alta apertura numérica (NA) que produce altas resoluciones laterales y axiales pero un FOV pequeño. Además, OCT es un sistema de imágenes lineales que proporciona una mayor flexibilidad a la hora de elegir la resolución y el FOV que se adaptan a su aplicación. En términos de profundidad de imagen, MPM generalmente proporciona profundidades de imagen de varios cientos de micrómetros en muestras biológicas donde existen alta dispersión y aberraciones, mientras que OCT utiliza el mayor poder de penetración de fuentes de luz infrarroja cercana para lograr profundidades de imagen de 1 a 2 mm en muestras biológicas. . La generación de imágenes volumétricas de muestras utilizando un sistema MPM requiere el uso de una platina del eje z con escaneo bidimensional en la dirección transversal para mover la muestra axialmente. Por el contrario, la OCT puede adquirir imágenes volumétricas utilizando únicamente escaneo rasterizado x-y sin mover la muestra axialmente. El sistema combinado MPM-OCT puede servir como una plataforma eficaz de imágenes a múltiples escalas para investigaciones biológicas mediante el uso complementario de la superioridad de cada sistema en imágenes.

Desde la introducción de la OCT, varios grupos de investigación investigaron y utilizaron las diferentes propiedades funcionales de la fuente láser y el mecanismo de detección para establecer nuevos métodos con respecto a los requisitos de imágenes. Varios ejemplos incluyen OCT Doppler para mediciones de flujo en muestras36, OCT sensible a la polarización para estudiar las propiedades de birrefringencia en la muestra37,38, elastografía de coherencia óptica para medir la tensión y la resistencia a la tracción de las estructuras dentro de las muestras37,38, OCT espectroscópica para investigar la longitud de onda dependiente absorción y dispersión de luz de estructuras en muestras37,38, y OCT fototérmica (PT-OCT) para analizar fluctuaciones térmicas dentro de muestras39,40,41. Entre estas tecnologías, PT-OCT ha atraído una importante atención investigadora para la evaluación de las fluctuaciones térmicas de muestras y los cambios resultantes en sus propiedades físicas y ópticas. En los sistemas PT-OCT, se han utilizado nanopartículas, agentes de contraste exógenos fototérmicos y absorbentes para generar y medir los efectos fototérmicos dentro de la muestra42,43,44,45. Hasta la fecha, los estudios que utilizan agentes de contraste endógenos en lugar de agentes de contraste externos han sido limitados debido a la falta de utilidad y la dificultad para medir señales de respuesta fototérmica débiles. Milner et al. propusieron una medición de fase diferencial para la detección en profundidad de la respuesta fototérmica en el tejido, sin el uso de contraste externo o material absorbente46,47. Aunque la técnica de detección de respuesta fototérmica propuesta se puede aplicar a muestras sin necesidad de contraste o absorbentes, requiere múltiples canales de detección dedicados y un retardo óptico de escaneo rápido para hacer coincidir las dos rutas interferométricas diferentes en el escaneo de muestras introducidas por el material birrefringente. Además, la potencia del láser de iluminación requerida suele ser de 80 a 100 mW para muestras biológicas, para medir la respuesta fototérmica con una relación señal-ruido razonable47. Los avances recientes en las técnicas PT-OCT han permitido mediciones efectivas de la respuesta fototérmica utilizando contraste endógeno utilizando un único canal de detección y con una potencia de iluminación láser reducida de 4 a 10 mW39,48,49,50.

Este estudio sirve como precursor de la dirección de un nuevo mecanismo de ubicación de ROI a lo largo de tres ejes dentro del volumen de muestra para reducir los efectos generales del fotodaño y el fotoblanqueo y mejorar la comodidad del usuario en imágenes multifotónicas de muestras volumétricas. Las regiones de interés deseadas se seleccionaron dentro de la profundidad observable completa y el rango lateral de la microscopía de coherencia óptica (OCM). Los cambios en las propiedades ópticas de la muestra debido a los efectos fototérmicos iluminados por la fuente láser MPM se midieron en las partículas fototérmicas endógenas dentro del ROI utilizando el OCM fototérmico de fase diferenciada (PD-PT) altamente sensible. Al monitorear el cambio temporal de la señal de respuesta fototérmica del OCM PD-PT, la posición de enfoque del láser de excitación (punto de acceso) se colocó en el ROI. Combinado con el movimiento automatizado de la muestra en el eje x-y, el plano focal de MPM podría navegarse de manera efectiva hasta la porción deseada de una muestra volumétrica para obtener imágenes de MPM específicas de alta resolución. La navegación ROI se logró utilizando una fuente láser MPM de baja potencia (inferior a la potencia convencional en un factor de menos de 10). El método de guía PD-PT OCM se puede implementar para cualquier técnica de imágenes no lineal que requiera iluminación láser de alta potencia, lo que conduce a fotoblanqueo y fotodaño en muestras, por ejemplo, fluorescencia excitada de dos fotones y microscopía de dispersión anti-Stokes Raman coherente.

Cuando un rayo láser de alta energía irradia una muestra, la temperatura interna y las propiedades ópticas de la estructura interna de la muestra cambian51. En la técnica de imágenes OCT, la señal de interferencia detectada en la OCT del dominio de Fourier se puede expresar como la ecuación. (1) en forma compleja:

donde z es la diferencia de longitud del camino entre el espejo de referencia y la interfaz dentro de la muestra. Los \({I}_{R}\) y \({I}_{S}\) son las intensidades de luz retrorreflejada del espejo de referencia y la interfaz de muestra, respectivamente. \(\Phi \left(z,t\right)\) es el término de fase de la señal de interferencia, que se puede representar como una función integral del índice de refracción dependiente de la profundidad en el espacio en un determinado momento, como expresado por la ecuación. (2):

donde ω es la frecuencia angular central de la fuente de luz y c es la velocidad de la luz en el vacío. Se supone que la muestra está ubicada en el lado positivo en el dominio espacial, y \(n\left(z,t\right)\) representa el índice de refracción dependiente de la profundidad y el tiempo dentro de la muestra. Cuando ocurre un cambio de temperatura dentro de la muestra, la respuesta térmica observada ópticamente en la muestra es un cambio de fase debido a los efectos termoelásticos y termorefractivos. Así, la ecuación. (2) se puede ampliar considerando las respuestas térmicas, expresadas por la ecuación. (3) (Ref.47).

donde dn/dT representa el cambio en el índice de refracción con la temperatura, \(\Delta T\left(z,t\right)\) representa el cambio de temperatura en los tejidos de la muestra y \(\beta\) es la expansión térmica coeficiente47. Para medir los cambios de fase en la muestra debido a la respuesta térmica cuando se ilumina con la fuente láser MPM, se obtuvieron señales de interferencia complejas como valores digitalizados con PD-PT OCM. El término de fase obtenido es la fase acumulada a lo largo de la profundidad. Por lo tanto, primero se requiere diferenciación para resolver la fase acumulada46,47,49, como lo expresa la ecuación. (4).

donde \(m\) es el índice de profundidad de los A-scan, y \(n\) denota los índices incrementales secuenciales designados desde la primera hasta la última señal de A-scan con el intervalo de tiempo \(\Delta t\). El número total N de escaneos A se obtuvo para la misma posición lateral en la muestra para aumentar la sensibilidad de la respuesta térmica. Se necesita un período de tiempo de T que es igual a \(\left(N-1\right)\) multiplicado por el intervalo \(\Delta t\). El N de A-scans se denomina marco. Se restan los escaneos A sucesivos para medir el cambio de fase a lo largo del tiempo, como lo expresa la ecuación. (5).

donde \(\varphi (m,n)\) es el ruido de fase aleatorio generado en el sistema dentro del intervalo de tiempo \(\Delta t\) para el índice espacial× m y el índice temporal n. En este estudio, se obtuvieron 801 exploraciones A durante el período de tiempo para lograr 800 exploraciones A diferenciadas. Las fases diferenciadas más allá del rango de −π y π se envolvieron con −2π para evitar posibles errores cerca de los límites –π y π. Se seleccionó una profundidad específica \(d\) de interés entre las profundidades de los escaneos A, y se lograron 800 valores de fase diferencial en la profundidad. d corresponde al producto de \({m}_{s}\) y \(\Delta z\), donde \({m}_{s}\) es el índice de profundidad seleccionado y \(\Delta z\ ) es el intervalo de profundidad. Promediamos esos valores de fase diferencial en una diferencia de fase efectiva que ocurrió dentro del período de tiempo para suprimir errores de fase aleatorios, mejorando así la sensibilidad de detección de respuesta térmica del sistema. El ruido de fase resulta principalmente de cambios térmicos ambientales y vibraciones mecánicas en el sistema. Luego se calculó la fase diferencial promediada \({\Delta \Phi }_{avg}(d)\) utilizando la ecuación. (6).

donde \(\Delta ={\Delta }_{t}{\Delta }_{z}\) y \(\Delta \Phi ({m}_{s},n)\) denotan los valores de fase diferencial en una profundidad específica d en la \({n}\)ésima señal de escaneo A diferenciada, respectivamente. Este proceso se repitió secuencialmente durante el número deseado de veces \(Fn\) (número de fotograma). En este caso, el término marco no debe confundirse con la denominación convencional de B-scan, que se utiliza habitualmente en imágenes OCT. El \(Fn\) son los 801 escaneos A acumulados desde un solo punto. El término "cuadro" se utiliza aquí para que los lectores contemplen y correlacionen la sensación de tiempo que lleva tener una señal PD-PT-OCM cuando pueden relacionarse con un B-scan para comprender la capacidad de medición de alta velocidad del método propuesto. Para perturbar la respuesta fototérmica en la muestra y generar el cambio de fase resultante con la fuente láser MPM, se incorporó un obturador mecánico en la trayectoria del haz de iluminación MPM y luego se controló de forma remota para abrir y cerrar en momentos específicos dentro de la duración de \( Fn\), según el requisito. A lo largo de este estudio, el valor máximo utilizado para \(Fn\) fue 50 a menos que se indique lo contrario. La medición de 50 fotogramas se denomina lectura de la respuesta fototérmica a la perturbación y corresponde a un ciclo de iluminación. El obturador se configuró para abrirse y cerrarse cerca del centro de cada ciclo de iluminación. Esto fue para garantizar que hubiera tiempo suficiente para que la muestra se enfriara a su temperatura natural. En la Fig. 1 se muestra la implementación de la acción del obturador para una lectura única de la respuesta fototérmica y el cambio de fase típico a lo largo del tiempo.

Relación entre el número de fotograma, la acción del obturador y la respuesta fototérmica durante un ciclo de iluminación.

Los agentes ópticos de absorción endógena, como lípidos, agua, melanina y hemoglobina, etc., están ampliamente presentes en los tejidos biológicos52. Después de seleccionar una ROI dentro de la imagen volumétrica OCM, se seleccionó un agente de absorción dentro de la ROI que exhibió una respuesta fototérmica apropiada como punto de observación para la respuesta fototérmica. Cuanto más cerca esté la posición focal de la luz de excitación del MPM al punto de observación, mayor será la respuesta fototérmica. Medimos múltiples respuestas fototérmicas mientras variamos la distancia entre el punto de observación y la posición focal del haz de iluminación, para determinar el punto en el que se maximizaba la respuesta fototérmica. Cabe señalar que el plano focal de la luz de excitación de MPM se colocó en la ROI y la imagen de MPM se pudo obtener inmediatamente sin tener que deambular para encontrar la ROI. En la Fig. 2 se muestra una representación esquemática del flujo de trabajo general antes mencionado. Combinado con el movimiento automatizado de la muestra en el eje x-y, la búsqueda de localización profunda del ROI se ha ampliado para explorarse en tres dimensiones.

Flujo de trabajo para la detección de respuesta fototérmica con el OCM PD–PT sin etiquetas. Descripción figurativa paso a paso del proceso involucrado en el cálculo de la señal fototérmica utilizando el OCM PD–PT.

Se fabricaron y utilizaron dos muestras fantasma diferentes en este estudio experimental para demostrar y caracterizar el MPM guiado por OCM PD-PT propuesto. La primera fue una muestra fantasma simple utilizada para evaluar el concepto y analizar la señal fototérmica detectada. Se utilizó una muestra fantasma adicional con una estructura de múltiples capas para validar la solidez de la aplicabilidad del sistema propuesto a una muestra compleja como la red de vasos sanguíneos de estructuras tisulares. Finalmente, lo aplicamos a una muestra de insecto (Ixodes dammini) con dimensiones de 4 × 4 × 1 mm, incrustada en un portaobjetos de microscopio, para evaluar la aplicabilidad práctica del sistema para muestras biológicas. La información detallada sobre las muestras utilizadas se proporciona en la sección “Materiales y métodos”.

Se utilizó una muestra fantasma simple (gel de ultrasonido) para caracterizar y analizar la respuesta fototérmica utilizando el método propuesto. El protocolo experimental fue similar para todos los experimentos realizados en este estudio (consulte la sección "Materiales y métodos" para conocer el protocolo experimental y la fabricación de muestras fantasma de red simple y compleja). La respuesta fototérmica se midió como se muestra en la Fig. 3. Las partículas de retrodispersión, como burbujas de aire o polvo, ubicadas en la región media del medio de gel, se seleccionaron en la imagen transversal OCM como punto de observación para la respuesta fototérmica. La posición focal del objetivo MPM se movió hacia arriba a lo largo del eje óptico del OCM, desde debajo del cubreobjetos y a través del área del gel ultrasónico de la muestra fantasma, como se muestra en la Fig. 3a. La respuesta fototérmica se midió por cada movimiento de 10 µm del objetivo MPM hasta 500 µm de la distancia total recorrida correspondiente a 50 lecturas. El tiempo total requerido para 51 lecturas fue de ~ 73 s. No se incluyó el tiempo dedicado a mover las traducciones manuales. Como se muestra en la Fig. 3b, la señal de respuesta fototérmica a intervalos de 100 µm de las lecturas totales se indica mediante el área del cuadro rectangular punteado. Se puede ver que la respuesta fototérmica máxima detectada en cada lectura mostró un aumento y una disminución constantes a medida que la posición del enfoque objetivo del MPM se acercaba y se alejaba de la región media de la muestra, respectivamente. Como se esperaba, la respuesta fototérmica se maximizó cuando pasó por la región media del gel. Las Figuras 3c, d son los gráficos ampliados que se muestran en la Fig. 3b, que indican las señales de respuesta fototérmica observadas cuando el punto focal del objetivo MPM estaba cerca de la mitad de la región del gel y las características detalladas de la respuesta fototérmica, respectivamente. Como se puede ver en las figuras 3b-d, la respuesta fototérmica detectada en todas las lecturas mostró dos picos que representan el cambio de diferencia de fase correspondiente a la perturbación máxima de temperatura. La temperatura en la muestra cambió más rápidamente justo después de abrir y cerrar el obturador. Cuando el obturador estaba abierto, el rayo láser MPM se enfocaba en la muestra, induciendo así efectos fototérmicos debido a cambios en la temperatura interna de la muestra, que se consideró como la primera región de perturbación de temperatura (aumento de temperatura), como se muestra en la Fig. 3c. Cuando la temperatura alcanzó su máximo y se estabilizó, el cambio en la diferencia de fase volvió a un valor cercano al de la temperatura de referencia en ausencia de iluminación. Cuando se cerró la persiana, la energía térmica acumulada en la muestra comenzó a disminuir. En otras palabras, cuando la causa del aumento de temperatura (rayo láser MPM) ya no está expuesta a la muestra, la temperatura general de la muestra disminuye y se estabiliza en su temperatura natural inicial. Esto puede verse como la segunda región de perturbación de la temperatura (disminución de la temperatura), como se muestra en la Fig. 3d.

Análisis de señal PD-PT OCM utilizando una muestra fantasma simple. (a) es la descripción figurativa del movimiento de la posición del enfoque del MPM en una profundidad variada. (b) es la respuesta fototérmica completa observada en la muestra fantasma simple dentro de un rango de profundidad de 500 µm. (c) es el gráfico ampliado de la respuesta fototérmica observada en la región media de la muestra. (d) es la respuesta fototérmica máxima observable dentro de la muestra. (e) son los valores de fase medios máximos representados en el rango de profundidad de 500 µm en la muestra. (f) es la gráfica trazada a partir de la diferencia absoluta entre valores sucesivos en (b). La figura (a) no está dibujada a escala.

Para analizar más a fondo la cantidad de respuesta fototérmica de acuerdo con el cambio de la posición focal de la lente del objetivo, los valores máximos en las señales fototérmicas se trazan con respecto a diferentes posiciones focales del objetivo MPM en profundidad, como se muestra en la Fig. 3e. Esto permite la visualización de la respuesta térmica general de la muestra. La línea discontinua roja en la Fig. 3e indica el punto de observación seleccionado del OCM para la respuesta fototérmica, dado que el objetivo del MPM se tradujo a lo largo de toda la profundidad de la muestra. Los tres picos de intensidad (negro) son las señales SHG detectadas correspondientes a la primera superficie del cubreobjetos, la segunda superficie del cubreobjetos y la primera superficie del portaobjetos de vidrio, respectivamente. El punto de observación de la respuesta fototérmica coincide con la mitad del área del gel entre las dos señales SHG que representan la segunda superficie del cubreobjetos y la primera superficie del portaobjetos de vidrio. Al aplicar un ajuste polinómico de quinto orden (para compensar el ruido de fase aleatorio inducido) a la curva de la señal fototérmica, se obtuvo una tendencia de transición suave de la curva. Además, en la figura 3f se muestra un gráfico que representa la diferencia absoluta entre valores sucesivos después del ajuste polinómico. Esto permite una visualización clara del momento en el que el foco del objetivo MPM coincidió con el punto de observación fijo.

Para evaluar la selección de ROI para imágenes no lineales utilizando PD-PT OCM, en el experimento se utilizaron muestras fantasma compuestas de múltiples capas de área grande que imitan la estructura tisular de los vasos sanguíneos o las redes neuronales. La muestra contenía un tejido de limpieza de lentes multicapa con un espesor de aproximadamente ~ 300 µm que se sumergió en agua destilada (consulte la sección "Materiales y métodos" para obtener más detalles). Se utiliza para validar la efectividad del método de selección de ROI utilizando las capacidades de imágenes transversales y frontales en tiempo real de OCM, que tiene un FOV más amplio que el FOV limitado de MPM. Esto se muestra en las figuras 4a-c,e,f. La Figura 4a presenta la imagen OCM volumétrica tridimensional (3D) de la muestra con un campo de visión de 3,0 × 3,5 × 0,3 mm a lo largo de los ejes horizontal, vertical y de profundidad. La imagen de volumen 3D está resaltada por dos regiones ROI rectangulares: la ROI inicial (naranja) y la ROI movida (azul) en las ubicaciones deseadas para la obtención de imágenes MPM. La Figura 4b, e presenta las imágenes OCM frontales con un FOV de 1,0 × 1,5 mm obtenido en las regiones ROI. Las Figuras 4c, f presentan imágenes ampliadas de las ROI que se muestran dentro de las áreas rectangulares de los cuadros azul y amarillo en la Fig. 4b, e, respectivamente, que se utilizaron para comparar con imágenes de SHG. El primer punto de observación dentro del ROI inicial se seleccionó a una profundidad de 100 μm, donde estaba cerca del cubreobjetos. El plano focal del objetivo MPM se posicionó utilizando el mecanismo de selección de ROI. Las Figuras 4e-g se obtuvieron después de mover la muestra a 1000 μm en las direcciones laterales de X e Y, respectivamente, y 100 μm en la dirección de profundidad hacia el portaobjetos de vidrio (eje Z); para simular la navegación de diferentes ROI (consulte la sección "Materiales y métodos" para obtener más detalles). Antes del movimiento de la muestra, la región seleccionada de la estructura del tejido para las imágenes de MPM estaba cerca del cubreobjetos; y después del movimiento de la muestra, la región de las estructuras de tejido de las que se van a obtener imágenes se reubicó más cerca de la primera superficie del portaobjetos de vidrio. La Figura 4d, g presenta las imágenes MPM SHG obtenidas antes y después del movimiento de la etapa de muestra. Las imágenes SHG fueron imágenes apiladas con un rango de profundidad de 70 µm dentro de los cuadros rectangulares naranja y azul representados en la imagen volumétrica OCM, y esto se hace para hacer coincidir y correlacionar mejor las imágenes frontales de MPM con las imágenes frontales de OCM. Las cruces huecas en las regiones roja, naranja y azul indicadas se correlacionan con posiciones coincidentes en las respectivas imágenes frontales de OCM y MPM.

Evaluación de la solidez del MPM guiado por OCM PD-PT con una muestra fantasma de red compleja. (a) es la imagen OCM volumétrica 3D de la muestra. (b, c, e, f) son imágenes OCM en persona de la muestra fantasma de la red compleja. (c, f) son las regiones ampliadas indicadas por cuadrados discontinuos en (b) y (e), respectivamente. (d, g) son las imágenes SHG en face apiladas de la misma ubicación escaneadas en (c) y (f). Además, en (a), los cuadros rectangulares en naranja y azul indican el rango de profundidad de apilamiento para imágenes SHG en las ROI iniciales y movidas en las ubicaciones deseadas, respectivamente.

Para validar la utilidad de la guía PD-PT OCM para las ROI en una muestra biológica de gran volumen para imágenes MPM, se utilizó una muestra biológica (hembra de Ixodes dammini) incrustada en un portaobjetos de microscopio. Antes de la obtención de imágenes fototérmicas, se tomaron imágenes de la muestra con el campo de visión máximo del OCM y se procesó posteriormente utilizando un software de reproducción de volumen. En la Fig. 5a se muestra una imagen OCM 3D renderizada en volumen, y en la Fig. 5b se muestra una imagen frontal de la imagen de volumen a una profundidad de 65 µm. Utilizando imágenes OCM transversales y frontales en tiempo real, se seleccionaron múltiples secciones diferentes de la muestra biológica utilizando el mecanismo de selección de ROI basado en la medición de la respuesta fototérmica con el OCM PD-PT. Se utiliza un área total de 4 × 4 mm (vertical × horizontal) para la selección de ROI. En particular, se seleccionaron y apuntaron cuatro regiones, que estaban ubicadas en la superficie superior del Scutum/escudo, el borde superior del palpo izquierdo, la punta del hipostoma y el borde superior del palpo derecho. Entre estas partes, se eligieron el hipostoma y los bordes izquierdo y derecho de los palpos, ya que estas partes de las garrapatas son más útiles en estudios de hábitats de alimentación de garrapatas relacionados con la enfermedad de Lyme53, y el escudo cubre la porción superior de la superficie dorsal. Casi todas las partes del cuerpo del espécimen ofrecieron una buena señal PD-PT-OCM observable, y es de destacar que la respuesta de la señal fototérmica se reduce a mayor espesor. Esto puede deberse a la composición y a las propiedades ópticas y térmicas de la muestra. Las imágenes SHG de las regiones objetivo se muestran en las figuras 5c-f, respectivamente. Las lecturas totales de las respuestas fototérmicas observadas en la región del hipostoma de acuerdo con las posiciones focales del objetivo MPM que varían en profundidad se muestran en el gráfico trazado en la Fig. 5g. El intervalo de paso entre dos posiciones de profundidad utilizadas aquí es de 20 µm. Se utilizaron un total de 11 lecturas para cubrir toda la región del hipostoma. Como se puede ver en el gráfico de una respuesta fototérmica representativa, como se muestra en la Fig. 5h, los picos máximos diferenciados de fase detectados no fueron inversamente proporcionales. Esto puede atribuirse a la expansión termoelástica de las estructuras biológicas del espécimen.

Verificación de la aplicabilidad del MPM guiado por OCM PD-PT propuesto para una muestra biológica. (a, b) son la imagen renderizada en volumen OCM respectiva y la imagen frontal de la muestra de insecto. Las figuras (c a f) son imágenes frontales de MPM de diferentes regiones de la muestra obtenidas utilizando la guía PD-PT OCM. (g) es la respuesta fototérmica representativa observada al variar la posición de profundidad del objetivo de MPM en la región del hipostoma de la muestra, y (h) es el gráfico representativo de una señal de respuesta fototérmica PD-PT OCM.

El uso de MPM ha ido ganando progresivamente popularidad en diversos escenarios de imágenes biomédicas. Una de esas áreas en las que la aplicabilidad del MPM ha aumentado son las investigaciones basadas en biochips. Actualmente, la investigación basada en biochips está evolucionando desde plataformas bidimensionales (2D) a plataformas 3D, similares al microambiente in vivo. En particular, es necesario establecer una complejidad biológica a gran escala para crear órganos artificiales para futuras pruebas de detección de drogas o eventuales reemplazos de órganos. Para lograrlo, actualmente se están investigando sobre impresión 3D y métodos de autoorganización basados ​​en organoides54,55. Para la obtención de imágenes en vivo a largo plazo y el análisis multiescala de muestras a gran escala, la microscopía no lineal capaz de obtener imágenes de tejido profundo e imágenes sin etiquetas es cada vez más importante56,57. Al realizar microscopía no lineal, se debe tener cuidado para evitar fotodaños. El método propuesto utiliza partículas endógenas dentro de la muestra para la ubicación del ROI en 3D en imágenes multifotónicas sin etiquetas. El método propuesto puede minimizar el fotodaño al identificar con precisión un ROI, donde se requieren imágenes moleculares 3D de alta resolución (información complementaria). Este concepto es similar al de la microscopía de contraste de fases, que se usa comúnmente en microscopios de fluorescencia para minimizar el fotoblanqueo, pero este mecanismo de guía convencional ofrece solo una imagen topológica 2D de la muestra. La OCT se puede utilizar como modalidad para obtener imágenes guiadas de tejidos biológicos gruesos, no transparentes y a gran escala en 3D, al igual que la microscopía de contraste de fase que se utiliza como herramienta guía de imágenes para muestras transparentes.

En el estudio actual, obtuvimos la curva de respuesta fototérmica mientras cambiamos manualmente el punto focal del objetivo MPM que se mueve hacia el punto de observación (objetivo OCM). La curva de respuesta fototérmica tiene la forma de una función unimodal con un valor máximo en el área de medición. En el futuro, incorporando un método de búsqueda eficiente bien establecido, como la búsqueda de sección áurea58, la búsqueda de Fibonacci59 o la búsqueda de ajuste de curvas60 (con un motor de enfoque axial automatizado incorporado con lente objetivo) en lugar de una búsqueda lineal de 50 intentos a intervalos. de 10 µm; el punto deseado se puede encontrar con la misma precisión en menos de 10 intentos. Además, el tiempo de búsqueda se puede reducir significativamente cuando el algoritmo de búsqueda de alta velocidad se combina con un dispositivo motorizado de alta velocidad para el escaneo axial del plano focal del objetivo MPM. En este estudio, el ROI se ubicó en una muestra biológica relativamente grande con dimensiones de 4 × 4 mm (vertical × horizontal), y se utilizó un total de 11 lecturas con un intervalo de paso de 20 µm en dirección de profundidad. El intervalo de paso y las lecturas totales se pueden elegir de forma adaptativa según la composición y el espesor de la muestra.

La probabilidad de que se produzca un error en la ubicación de la ROI (en profundidad) para la guía objetiva del MPM depende de la resolución axial del sistema OCM y de la sensibilidad de fase. La resolución axial del sistema OCM utilizado es de ~ 5 µm. Por lo tanto, la precisión de la guía objetiva del MPM es la misma que la resolución axial del OCM. El sistema de imágenes multimodal propuesto está configurado de manera que el OCM y el MPM estén alineados coaxialmente y en lados opuestos de la muestra. El método demostrado mide la posición absoluta del punto de acceso del objetivo MPM dentro de la muestra, por lo tanto, incluso si se utiliza una muestra con estructuras e interfaces de muestra complejas, el rendimiento de la detección PD-PT-OCM no está sujeto a mediciones erróneas. El campo de visión del sistema PD-PT-OCM se puede cambiar de forma adaptativa según los requisitos de imagen cambiando las lentes del objetivo en la configuración del brazo de referencia y de muestra. Sin embargo, el FOV y la resolución lateral están inversamente relacionados. En general, los objetivos con FOV más amplios tendrán una resolución lateral más baja y viceversa. La capacidad de obtención de imágenes con resolución profunda de OCM se reduce en muestras gruesas. Esto se debe a las limitaciones de la penetración de la luz en los tejidos gruesos. Además, en muestras gruesas con estructuras complejas densamente empaquetadas, las señales detectables generadas por multifotones se reducen en tejidos más profundos. Así, el calor generado por el punto de acceso de MPM también se degradará en los tejidos más profundos. La usabilidad de los métodos propuestos para la selección de ROI utilizando OCM no se limita solo al espesor de la muestra fantasma que se informa aquí. La selección de ROI dentro de la muestra es posible en todo el rango de profundidad óptica de OCM y solo depende de la composición de la muestra y de la óptica utilizada para el sistema OCM. La señal fototérmica generada dentro de la muestra se puede detectar eficazmente en todo el rango de profundidad observable del PD-PT-OCM. La disipación de la señal fototérmica y la degradación de la eficiencia de detección dependerán del espesor de la muestra, su composición y sus propiedades ópticas y térmicas51.

Convencionalmente, las imágenes fototérmicas OCT se utilizan para obtener imágenes de vasos sanguíneos utilizando el efecto fototérmico de las células sanguíneas, que son sustancias endógenas, o para medir la ubicación y los puntos calientes de partículas fotorreactivas exógenas, como polímeros y nanobarras de oro en tejidos vivos. El OCM PD-PT de alta sensibilidad también se puede utilizar si hay factores endógenos o exógenos presentes dentro del rango observable de la imagen OCM. Usando el método propuesto, podemos enfocar cuidadosamente la iluminación de excitación para la terapia fototérmica con sustancias exógenas y restringirla localmente a la ubicación deseada, evitando así el calentamiento innecesario de los tejidos normales.

En resumen, este artículo sirve como un informe preliminar para presentar la usabilidad potencial de emplear PD-PT OCM como herramienta de guía para microscopía no lineal para navegar de manera efectiva y precisa por los ROI en muestras de gran volumen. Las regiones de interés se seleccionaron utilizando el gran campo de visión y el rango de profundidad observable en imágenes OCM frontales y transversales. Para lograr imágenes MPM específicas dentro de las regiones de interés en 3D, se detectaron puntos críticos que se producen dentro de la muestra enfocada con el láser MPM a una potencia débil utilizando el OCM PD-PT altamente sensible. Luego enfocamos el láser MPM en un punto de observación seleccionado entre los agentes de absorción endógenos en el ROI. El OCM PD-PT permite colocar la posición focal del objetivo MPM en la ROI dentro del rango de profundidad observable de la imagen transversal del OCM. Encontrar y orientar eficazmente los ROI que requieren imágenes MPM de alta resolución puede reducir el tiempo de exposición general de los láseres de alta potencia, especialmente para muestras grandes, mitigando significativamente el fotoblanqueo y el fotodaño. El sistema PD-PT OCM de alta sensibilidad tiene aplicaciones potenciales para el análisis de reacciones fototérmicas porque puede detectar en tiempo real incluso cambios de temperatura debido a una perturbación fototérmica débil que ocurre dentro de muestras biológicas tridimensionales. Además, cabe señalar que la utilidad del método de guía propuesto basado en PD-PT OCM se puede implementar para cualquier técnica de imágenes no lineal que requiera iluminación láser de alta potencia (que puede provocar fotoblanqueo y fotodaño en las muestras), como dos -fluorescencia excitada por fotones y microscopía de dispersión anti-Stokes Raman coherente. Esto reduce el tiempo total de adquisición requerido para la ubicación de la ROI en sistemas de imágenes no lineales.

La configuración general del sistema de imágenes multimodal se ilustra en la Fig. 6. La plataforma de imágenes multimodal tenía dos fuentes de luz independientes. El sistema OCM estaba alimentado por una fuente de luz de banda ancha superluminiscente (SLD-37-HP3, Superlum Diodes Ltd., Carrigtwohill, Irlanda) con una potencia máxima de 18 mW centrada en 840 nm. La salida de la fuente se conectó directamente al puerto de entrada de un circulador óptico (850-H7-L-15-FA, OF-LINK Communications Co., Ltd. Shenzhen China). El puerto de salida del circulador se conectó a un colimador doble (F240APC-850, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.) con un tamaño de haz de 2,4 mm. El haz colimado se escaneó en trama a lo largo de los ejes horizontal y vertical utilizando un espejo de escaneo galvanométrico de doble eje (GVSM002-JP, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.). Posteriormente, el haz de escaneo se dirigió hacia una combinación de lentes de escaneo y de tubo con longitudes focales de 54 mm (LSM04-BB, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.) y 200 mm (TTL200-B, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.). Estados Unidos), respectivamente. Con esta configuración, el tamaño del haz óptico (del colimador) se magnificó en un factor de 3,7. Luego, el haz ampliado se dividió mediante un divisor de haz rectangular (BSW11, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.) en una proporción de 50:50. Los haces divididos se dirigieron al brazo de referencia y a la configuración del brazo de muestra. El haz hacia la trayectoria de referencia pasó a través de una combinación de sistemas ópticos como un atenuador variable continuo (NDC-50C-4 M, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) y una lente objetivo de 4 × (UPlanFL N 4.0x, Olympus, Tokio, Japón) con una distancia focal de 45 mm, seguido de un espejo de banda ancha altamente reflectante (PF10-03-P01P, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.). De manera similar, en la ruta de muestra, el haz dividido incidente se dirigió a una lente objetivo que coincidía con las especificaciones de la lente objetivo utilizada en la ruta de referencia. El rayo láser reflejado hacia atrás desde la superficie de la muestra interfirió con el haz de referencia reflejado hacia atrás en el divisor de haz. La señal de interferencia retrodispersada se dirigió a través de un circulador a un espectrómetro que contenía una cámara de barrido lineal (Sprint spl4096-140k, Basler AG, Ahrensburg, Alemania) con 4096 píxeles. En la configuración actual, el espectro cubría solo la parte media del sensor de la cámara y solo se utilizaron 2048 píxeles en la cámara de escaneo lineal. Las señales detectadas se procesaron en una computadora para mostrar las imágenes OCM transversales y frontales en tiempo real. El sistema OCM construido tenía resoluciones axiales y laterales de ~ 5 µm y un campo de visión máximo de 4 × 4 × 1 mm a lo largo de los ejes horizontal, vertical y de profundidad, respectivamente. Se escaneó sucesivamente un conjunto de 250 posiciones laterales (línea A) para construir una imagen OCM transversal 2D, y se escanearon 250 posiciones horizontales (imágenes 2D) para obtener un conjunto de imágenes de volumen. Se seleccionó una profundidad específica del conjunto de imágenes de volumen (según sea necesario) para obtener una imagen frontal en tiempo real. El sistema OCM tenía una velocidad promedio de 90 fotogramas por segundo.

Esquema del sistema de imágenes multimodal. Esquema de diseño óptico con los componentes ópticos utilizados junto con las fuentes MPM y OCM, los componentes de detección y la etapa de muestra traslacional micrométrica de dos ejes. Figura no dibujada a escala.

El sistema MPM tenía una fuente láser de fibra de femtosegundo de alta potencia (ELMO HP, Menlo Systems, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.) con una potencia de salida máxima de 180 mW y un ancho de pulso de <70 fs (normalmente 45 fs), y una tasa de repetición de 100 MHz. La fuente láser estaba centrada a 1560 nm, con un ancho de banda espectral de 30 nm. El rayo láser se colimó utilizando un colimador óptico triplete (TC18APC-1550, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.) con un tamaño de haz de aproximadamente ~ 3 mm. La potencia del láser se controló según fuera necesario mediante una combinación de atenuadores ópticos. Luego, el haz de propagación pasó a través de un obturador mecánico controlado electrónicamente (SHB025, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.). La computadora controló el obturador mecánico para obtener iluminación óptica en la región de la muestra durante un tiempo de operación específico, según sea necesario. El rayo láser posterior después del obturador se escaneó en forma de trama a lo largo de los ejes horizontal y vertical utilizando un espejo de escaneo galvanométrico de doble eje (GVSM002-JP, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.). Luego, el rayo láser pasó a través de una combinación de lentes de escaneo (SL50-2P2, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.) y lentes de tubo (TTL200MP, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.) con longitudes focales de 50 mm y 200 mm. , respectivamente. Esta combinación óptica magnificó el rayo láser en un factor de 4. El rayo láser colimado y magnificado se propagó a través de un espejo dicroico (FF801-Di02-25 × 36, IDEX Health & Science, LLC, Nueva York, EE. UU.). El espejo dicroico se colocó con un ángulo de inclinación de 45° con respecto al rayo láser incidente. Luego, el rayo láser MPM redirigido se enfocó en la muestra utilizando un objetivo asférico de 30 × (5723-CH 30x, Newport Corporation, CA, EE. UU.) con una longitud focal de 6,2 mm. El rayo láser MPM enfocado en la muestra generó señales SHG a partir de moléculas de muestras, que fueron retrodispersadas y recolectadas por la lente objetivo. Las señales SHG retrodispersadas se transmitieron luego a través del espejo dicroico, que se dirigió a una lente de tubo (TTL200MP, Thorlabs, Inc., NJ, EE. UU.) con una distancia focal de 200 mm, filtro de paso de banda (FF01-794/32-25, IDEX Health & Science, LLC, Nueva York, EE. UU.) y lente doblete acromática (AC254-050-B, Thorlabs, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.) con una distancia focal de 50 mm. Este haz se transmitió a un tubo fotomultiplicador (H7422-50, Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japón). Las señales convertidas eléctricamente se preamplificaron y luego se transmitieron a una computadora para su posterior procesamiento, para obtener las imágenes MPM SHG frontales de la muestra. El sistema MPM tenía una resolución de aproximadamente ~ 1 µm. Con la configuración óptica indicada, se logró un campo de visión máximo de 300 × 300 µm.

Los sistemas de imágenes OCM y MPM se montaron en un microscopio (OLYMPUS-IX73, Olympus, Tokio, Japón) desde las direcciones superior e inferior, respectivamente, y los rayos láser OCM y MPM se alinearon coaxialmente. Las coordenadas xey del ROI para el MPM de alta resolución se seleccionaron a partir de la imagen OCM frontal en tiempo real. Seleccionamos la coordenada de profundidad del ROI de la imagen OCM transversal correlacionada, que era la posición de profundidad para observar la respuesta fototérmica. La orientación lateral del ROI seleccionado para el MPM se implementó mediante el movimiento de traslación de una etapa de microposicionamiento (X e Y) (MCL-MOTNZ, Mad City Labs Inc., WI, EE. UU.). Luego, la luz de excitación del MPM se enfocó en la posición de profundidad del ROI observando los cambios en la respuesta fototérmica mientras se cambiaba la posición focal del MPM con respecto al movimiento axial incorporado del cuerpo del microscopio. El movimiento traslacional de la muestra se automatizó utilizando el programa LabVIEW, mientras que el movimiento axial se controló manualmente.

Para evaluar y analizar la metodología y la solidez del sistema de imágenes MPM multimodal PD-PT guiado por OCM propuesto, se fabricaron dos muestras fantasma. Una de las muestras se preparó colocando un gel ultrasónico disponible comercialmente en un portaobjetos de vidrio de 1 mm, y se apiló un cubreobjetos de 170 ± 5 µm de espesor sobre el gel ultrasónico, como se muestra en la Fig. 7a. Aquí se utiliza gel ultrasónico porque sus propiedades térmicas son más estables y su conductividad térmica es cercana a la de los tejidos biológicos61. El espesor total de la muestra fabricada fue de ~ 1500 µm y el espesor del gel de ultrasonido introducido fue de ~ 330 µm. De manera similar, desarrollamos una muestra fantasma de red compleja de múltiples capas para imitar estructuras de red complejas en tejidos biológicos, como se muestra en la Fig. 7b. Se utilizaron tejidos de lentes multicapa con un espesor total de ~ 300 µm y agua destilada en lugar del gel de ultrasonido, y el espesor total de la muestra fue de ~ 1470 µm. Se utilizó un epoxi de fraguado rápido para sellar el área que rodea el cubreobjetos en ambas muestras para evitar la evaporación del agua. La muestra se montó con un cubreobjetos orientado hacia el objetivo MPM, mientras que el portaobjetos de vidrio se orientó hacia el OCM, como se muestra en las figuras 7a,b. Para demostrar la utilidad de la guía PD-PT OCM para las ROI en una muestra biológica de gran volumen para imágenes MPM, se utilizó una muestra biológica (Ixodes dammini (Deer Tick) Female, wm Microscope Slide, Carolina Biological Supply, NC, EE. UU.) incrustada en un Se utilizó un portaobjetos de microscopio de 3 mm de largo y ancho (excluyendo algunas partes de las patas). Para obtener las respuestas fototérmicas PD-PT OCM de las muestras fantasma y la muestra biológica, la posición inicial de enfoque del objetivo MPM se colocó 30 µm debajo del cubreobjetos y la lente del objetivo MPM se movió axialmente hacia la muestra en incrementos de intervalos de paso de 10 µm. , como se muestra en la Fig. 7c. Tras cada movimiento del objetivo MPM, el obturador mecánico se configuró para que se abriera durante el período de tiempo deseado (350 ms, a menos que se indique lo contrario) para cada adquisición de señal PD-PT OCM. Los puntos de observación del OCM, donde se midieron las respuestas fototérmicas, se seleccionaron entre los puntos dentro del ROI que proporcionaron la señal fototérmica adecuada. Básicamente, el intervalo de pasos indicado aquí no es un valor absoluto que deba respetarse estrictamente. Por ejemplo, se empleó un intervalo de paso de 20 µm para generar la respuesta fototérmica del espécimen biológico (hembra de Ixodes dammini) que se muestra en la Fig. 5. El intervalo de paso y las lecturas totales se pueden seleccionar de forma adaptativa en función de la composición y el espesor de la muestra.

Esquema de muestras fantasma y el protocolo experimental PD-PT OCM. (a) es la representación esquemática en sección transversal de la muestra fantasma simple fabricada con gel de ultrasonido. (b) es una representación esquemática en sección transversal de la muestra fantasma de red compleja fabricada con tejido de lente multicapa. c es la representación figurativa del posicionamiento objetivo de MPM para la metodología basada en PD-PT OCM. Figuras no dibujadas a escala.

Todos los datos necesarios necesarios para analizar y reproducir los resultados y conclusiones presentados en el manuscrito se proporcionan en las secciones relevantes del manuscrito. Detalles y datos adicionales relacionados con este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Dombeck, DA, Khabbaz, AN, Collman, F., Adelman, TL y Tank, DW Imágenes de actividad neuronal a gran escala con resolución celular en ratones despiertos y móviles. Neurona 56, 43–57 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, H. y col. Imágenes de microscopía de fluorescencia de tres fotones de gran profundidad de la microvasculatura cortical en primates no humanos con una sonda AIE brillante in vivo. Biomateriales 289, 121809 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sofroniew, Nueva Jersey, Flickinger, D., King, J. y Svoboda, K. Un mesoscopio de dos fotones de gran campo de visión con resolución subcelular para imágenes in vivo. Elife 5, 1-20 (2016).

Artículo de Google Scholar

Sacconi, L., Dombeck, DA y Webb, WW Superación del fotodaño en microscopía de generación de segundo armónico: registro óptico en tiempo real de potenciales de acción neuronales. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 103, 3124–3129 (2006).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lecoq, J., Orlova, N. y Grewe, BF Wide. Rápido. Profundo: avances recientes en microscopía multifotónica de la actividad neuronal in vivo. J. Neurosci. 39, 9042–9052 (2019).

Lin, H. y col. Avances recientes en microscopía multifotónica combinada con nanomateriales en el campo de la evolución de enfermedades y aplicaciones clínicas del cáncer de hígado. Nanoescala 11, 19619–19635 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Balu, M. y col. Microscopía multifotónica in vivo del carcinoma de células basales. JAMA Dermatol. 151, 1068-1074 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kirkpatrick, N. y col. Microscopía multifotónica de barrido resonante a velocidad de vídeo: una técnica emergente para la obtención de imágenes intravitales del microambiente tumoral. IntraVital 1, 60–68 (2012).

Artículo de Google Scholar

Provenzano, PP, Eliceiri, KW & Keely, PJ Microscopía multifotónica y microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM) para monitorear la metástasis y el microambiente del tumor. Clínico. Exp. Metástasis 26, 357–370 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mazzarda, F. et al. El modelo de órgano en chip muestra que la liberación de ATP a través de hemicanales de conexina impulsa la señalización espontánea de Ca2+ en células no sensoriales de la cresta epitelial mayor de la cóclea en desarrollo. Laboratorio. Ficha 20, 3011–3023 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Peel, S. y Jackman, M. Sistemas microfisiológicos de imágenes: una revisión. Soy. J. Physiol. Fisiol celular. 320, C669-C680 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Malak, M., Grantham, J. y Ericson, MB Monitoreo de la diferenciación epidérmica inducida por calcio in vitro mediante microscopía multifotónica. J. Biomed. Optar. 25, 1 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Miller, DR, Jarrett, JW, Hassan, AM y Dunn, AK Imágenes de tejido profundo con microscopía de fluorescencia multifotónica. actual. Opinión. Biomédica. Ing. 4, 32–39 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Leemans, S., Dvornikov, A., Gallagher, T. & Gratton, E. AO DIVER: Desarrollo de un sistema de óptica adaptativa tridimensional para avanzar en los límites de profundidad de las imágenes multifotónicas. Fotón APL. 5, 120801 (2020).

ADS del artículo Google Scholar

Sheetz, KE, Hoover, EE, Carriles, R., Kleinfeld, D. & Squier, JA Avance de la microscopía no lineal multifocal: desarrollo y aplicación de un nuevo oscilador multihaz Yb:KGd(WO_4)_2. Optar. Expreso 16, 17574 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Ota, K., Uwamori, H., Ode, T. y Murayama, M. Rompiendo concesiones: desarrollo de microscopios de dos fotones rápidos, de alta resolución y de campo amplio para revelar los principios computacionales del cerebro. Neurociencias. Res. 179, 3-14 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Campo, JJ y col. Microscopía diferencial de barrido láser multifotónico. IEEE J. Sel. Arriba. Electrón cuántico. 18, 14-28 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Cheng, L.-C. et al. Microscopía multifotónica de campo amplio basada en enfoque espaciotemporal para un corte óptico rápido. Optar. Expreso 20, 8939 (2012).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Hoover, EE y Squier, JA Avances en la tecnología de microscopía multifotónica. Nat. Fotón. 7, 93-101 (2013).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Borah, BJ y cols. Adquisición de alta velocidad de vóxeles que supera Nyquist en microscopía multifotónica mesoscópica para resolución submicrónica de campo completo. iCiencia 24, 103041 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rápido, A. et al. Exoscopio multifotónico rápido y de gran área (FLAME) para obtener imágenes macroscópicas con resolución microscópica de la piel humana. Ciencia. Representante 10, 1-14 (2020).

Artículo de Google Scholar

Galli, R. y col. Indicador intrínseco de fotodaño durante la microscopía multifotónica sin etiquetas de células y tejidos. MÁS UNO 9, 19-23 (2014).

Artículo de Google Scholar

Tauer, U. Imágenes dinámicas confocales del cerebro vivo Ventajas y riesgos de la microscopía multifotónica en fisiología Fisiología experimental: La microscopía multifotónica se basa en la absorción simultánea de dos fotones emitidos por un Physiol experimental infrarrojo pulsado. Exp. Fisiol. 87(6), 709–714 (2002).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Macias-Romero, C., Zubkovs, V., Wang, S. & Roke, S. La microscopía multifotónica de campo amplio y tasa de repetición media reduce el fotodaño de las células vivas. Biomédica. Optar. Expreso 7, 1458 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stephens, DJ y Allan, VJ Técnicas de microscopía óptica para obtener imágenes de células vivas. Ciencia (80-.) 300, 82–86 (2003).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Rieder, CL y Khodjakov, A. Mitosis a través del microscopio: avances en la visión del interior de las células vivas en división. Ciencia (80-.) 300, 91–96 (2003).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Hoebe, RA y cols. La microscopía de exposición a la luz controlada reduce el fotoblanqueo y la fototoxicidad en las imágenes fluorescentes de células vivas. Nat. Biotecnología. 25, 249–253 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ji, N., Magee, JC y Betzig, E. Imágenes no lineales de alta velocidad y bajo fotodaño utilizando divisores de pulso pasivos. Nat. Métodos 5, 197–202 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Saggau, P. Nuevos métodos y usos para el escaneo óptico rápido. actual. Opinión. Neurobiol. 16, 543–550 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Liang, W. y col. Mayor uniformidad de iluminación y reducción del fotodaño que ofrece el escaneo de Lissajous en endomicroscopía de dos fotones con fibra óptica. J. Biomed. Optar. 17, 021108 (2012).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reynaud, EG, Kržič, U., Greger, K. & Stelzer, EHK Microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz: más dimensiones, más fotones y menos fotodaño. HFSP J. 2, 266–275 (2008).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, S., Krasieva, TB, Chen, Z. y Tromberg, BJ Microscopía multifotónica combinada y tomografía de coherencia óptica utilizando una fuente de banda ancha de 12 fs. J. Biomed. Optar. 11, 020502 (2006).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Tang, S., Zhou, Y. & Ju, MJ Imágenes ópticas multimodales con microscopía multifotónica y tomografía de coherencia óptica. J. Biofotónica 5, 396–403 (2012).

Artículo PubMed Google Scholar

Graf, BW & Boppart, SA Imágenes de piel multimodales in vivo con coherencia óptica integrada y microscopía multifotónica. IEEE J. Sel. Arriba. Electrón cuántico. 18, 1280-1286 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Lai, T., Chong, SP, Zhou, Y., Moloney, G. & Tang, S. Imágenes corneales y medición del índice de refracción utilizando un sistema combinado de microscopía multifotónica y tomografía de coherencia óptica. Multifoto. Microscopía. Biomédica. Ciencia. XIII 8588, 85882S (2013).

Artículo de Google Scholar

Jeon, D., Ravichandran, NK, Jung, U., Jeon, M. y Kim, J. Tomografía Doppler óptica con sonda portátil para imágenes del flujo sanguíneo. Física infrarroja. Tecnología. 95, 183–188 (2018).

ADS del artículo Google Scholar

Kim, J., Brown, W., Maher, JR, Levinson, H. & Wax, A. Tomografía de coherencia óptica funcional: principios y avances. Física. Medicina. Biol. 60, R211–R237 (2015).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stifter, D. Más allá de la biomedicina: una revisión de aplicaciones y desarrollos alternativos para la tomografía de coherencia óptica. Aplica. Física. Opción de láseres B. 88, 337–357 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Lapierre-Landry, M., Gordon, AY, Penn, JS y Skala, MC Tomografía de coherencia óptica fototérmica in vivo de agentes de contraste endógenos y exógenos en el ojo. Ciencia. Representante 7, 1–9 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Tucker-Schwartz, JM, Lapierre-Landry, M., Patil, CA y Skala, MC Tomografía de coherencia óptica fototérmica con bloqueo óptico para imágenes in vivo. Biomédica. Optar. Expreso 6, 2268 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tucker-Schwartz, JM, Meyer, TA, Patil, CA, Duvall, CL y Skala, MC Tomografía de coherencia óptica fototérmica in vivo de agentes de contraste de nanobarras de oro. Biomédica. Optar. Expreso 3, 2881 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, Y., Podoleanu, A. & Dobre, G. Tomografía de coherencia óptica fototérmica para la investigación y obtención de imágenes de captura fototérmica de nanobarras de oro en medios transparentes y tejido biológico. J. Optar. (Reino Unido) 21, 095301 (2019).

ADS CAS Google Académico

Adler, DC, Huang, S.-W., Huber, R. y Fujimoto, JG Detección fototérmica de nanopartículas de oro mediante tomografía de coherencia óptica sensible a fases. Optar. Expreso 16, 4376 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Lapierre-Landry, M., Connor, TB, Carroll, J., Tao, YK y Skala, MC Tomografía de coherencia óptica fototérmica de verde de indocianina en ojos ex vivo. Optar. Letón. 43, 2470 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guan, G., Reif, R., Huang, Z. y Wang, RK Perfiles de profundidad de concentraciones de compuestos fototérmicos mediante tomografía de coherencia óptica sensible a la fase. J. Biomed. Optar. 16, 126003 (2011).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davé, DP & Milner, TE Reflectómetro óptico de baja coherencia para medición de fase diferencial. Optar. Letón. 25, 227 (2000).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Telenkov, SA, Dave, DP, Sethuraman, S., Akkin, T. y Milner, TE Sonda de coherencia óptica de fase diferencial para la detección en profundidad de la respuesta fototérmica en tejido. Física. Medicina. Biol. 49, 111-119 (2004).

Artículo PubMed Google Scholar

Tang, P. y col. Tomografía de coherencia óptica fototérmica de correlación cruzada con alta resolución efectiva. Optar. Letón. 42, 4974 (2017).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Makita, S. & Yasuno, Y. Tomografía de coherencia óptica fototérmica in vivo para obtener imágenes no invasivas de agentes de absorción endógenos. Biomédica. Optar. Expreso 6, 1707 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lapierre-Landry, M. et al. Imágenes de la distribución de melanina en la retina del pez cebra mediante tomografía de coherencia óptica fototérmica. Traducción Vis. Ciencia. Tecnología. 7, 4 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Welch, AJ y van Gemert, MJC Respuesta óptico-térmica del tejido irradiado con láser vol. 148 (Springer, Países Bajos, 2011).

Reservar Google Académico

Tsang, VTC, Li, X. & Wong, TTW Una revisión de agentes de contraste endógenos y exógenos utilizados en tomografía fotoacústica con diferentes configuraciones de detección. Sensores (Suiza) 20, 1–20 (2020).

Artículo de Google Scholar

Bockenstedt, LK y cols. Qué hacen las garrapatas debajo de la piel: imágenes intravitales de dos fotones de Ixodes scapularis alimentándose en presencia de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme. Yale J. Biol. Medicina. 87, 3-13 (2014).

PubMed PubMed Central Google Académico

Brassard, JA & Lutolf, MP Ingeniería de autoorganización de células madre para construir mejores organoides. Célula madre celular 24, 860–876 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Brassard, JA, Nikolaev, M., Hübscher, T., Hofer, M. y Lutolf, MP Recapitulando la autoorganización de los tejidos a macroescala mediante la bioimpresión de organoides. Nat. Madre. 20, 22-29 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Hof, L. y col. Las imágenes en vivo a largo plazo y el análisis multiescala identifican la heterogeneidad y los principios básicos de la morfogénesis de los organoides epiteliales. BMC Biol. 19, 1-22 (2021).

Artículo de Google Scholar

Fei, K., Zhang, J., Yuan, J. y Xiao, P. Aplicación actual y perspectivas de la tecnología de imágenes de organoides. Bioingeniería 9, 121 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marks, DL, Oldenburg, AL, Reynolds, JJ y Boppart, SA Algoritmo de enfoque automático para la corrección de la dispersión en tomografía de coherencia óptica. Aplica. Optar. 42, 3038 (2003).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Yeo, T., Ong, S., Jayasooriah y Sinniah, R. Enfoque automático para microscopía de tejidos. Imagen Vis. Computadora. 11, 629–639 (1993).

Artículo de Google Scholar

Subbarao, M., Tyan, J. & Brook, S. Selección de la medida de enfoque óptima para el enfoque automático y la profundidad del enfoque. Nueva York 20, 864–870 (1998).

Google Académico

Agafonkina, IV et al. Propiedades térmicas de los fantasmas de gel de tejidos biológicos en un amplio rango de bajas temperaturas. J. Ing. Física. Termofis. 94, 790–803 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Ciencias Básicas de Corea [número de subvención D300300 y C330210] y el Instituto de Planificación y Evaluación de Tecnologías de la Información y las Comunicaciones (IITP), financiado por el gobierno coreano (MSIT) [No. 1711152793].

Centro de Instrumentación Científica, Instituto de Ciencias Básicas de Corea, 169-148 Gwahak-ro Yuseong-gu, Daejeon, 34133, República de Corea

Naresh Kumar Ravichandran, Hwan Hur, Hyemi Kim, Sangwon Hyun, Ji Yong Bae, Dong Uk Kim, I Jong Kim, Ki-Hwan Nam, Ki Soo Chang y Kye-Sung Lee

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KSL desarrolló el concepto de diseño y codesarrolló el sistema de imágenes. RNK codesarrolló el sistema, realizó experimentos y procesó datos. RNK escribió el borrador del manuscrito. KSL y KSC revisaron críticamente el manuscrito. HK fabricó la muestra del biochip utilizada en información complementaria. Todos los autores participaron en las discusiones y contribuyeron a la redacción y revisión del manuscrito.

Correspondencia a Ki Soo Chang o Kye-Sung Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Ravichandran, NK, Hur, H., Kim, H. et al. Microscopía de coherencia óptica fototérmica sin etiquetas para localizar regiones de interés deseadas en imágenes multifotónicas de muestras volumétricas. Informe científico 13, 3625 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30524-z

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Recibido: 27 de octubre de 2022

Aceptado: 24 de febrero de 2023

Publicado: 03 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30524-z

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