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May 26, 2024

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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 263 (2023) Cita este artículo 1404 Accesos 3 Citas 1 Detalles de Altmetric Metrics El cierre del tubo neural (NTC) es un proceso complejo de desarrollo embrionario

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 263 (2023) Citar este artículo

1404 Accesos

3 citas

1 altmétrica

Detalles de métricas

El cierre del tubo neural (CNT) es un proceso complejo de desarrollo embrionario que involucra mecanismos moleculares, celulares y biomecánicos. Si bien los factores genéticos y la señalización bioquímica se han investigado ampliamente, el papel de la biomecánica de los tejidos sigue sin explorarse debido a la falta de herramientas. Aquí, desarrollamos una modalidad óptica que puede realizar imágenes mecánicas en lapso de tiempo del tejido de la placa neural mientras el embrión experimenta la neurulación. Esta técnica se basa en la combinación de un microscopio confocal Brillouin y un cultivo ex ovo modificado de embriones de pollo con una incubadora en escena. Con esta técnica, por primera vez capturamos la evolución mecánica del tejido de la placa neural con embriones vivos. Específicamente, observamos el aumento continuo en el módulo tisular de la placa neural durante el NTC para embriones cultivados ex ovo, lo que es consistente con los datos del cultivo in ovo, así como con estudios previos. Más allá de eso, encontramos que el aumento en el módulo del tejido estaba altamente correlacionado con el engrosamiento y la flexión del tejido. Prevemos que esta técnica sin contacto y sin etiquetas abrirá nuevas oportunidades para comprender los mecanismos biomecánicos en el desarrollo embrionario.

El cierre del tubo neural (NTC) es un procedimiento central de neurulación de vertebrados donde la placa neural plana se elevará y fusionará para formar un tubo neural hueco. Un fallo de este procedimiento puede provocar defectos graves del tubo neural, que representan uno de los defectos congénitos humanos más comunes1. Los procesos genéticos y moleculares que guían el NTC se han estudiado ampliamente durante muchas décadas2,3,4. Por otro lado, los mecanismos biomecánicos que pueden estar implicados en el NTC están atrayendo cada vez más atención en los últimos años5,6,7. A nivel celular y tisular, la morfogénesis del tubo neural puede considerarse como resultado de la interacción entre la fuerza generada y la resistencia mecánica del tejido embrionario8,9: el cierre exitoso del tubo neural requiere que la fuerza intrínseca pueda superar la tensión tisular opuesta que depende de su propiedad elástica. Como tal, la alteración de la biomecánica del tejido puede provocar un fallo de cierre y, por tanto, una malformación del tubo neural10. Aunque la producción de fuerza y ​​el cambio mecánico del tejido durante el procedimiento de NTC se han observado en experimentos10,11,12, la contribución cuantitativa de procesos biomecánicos específicos para garantizar una neurulación robusta sigue siendo en gran medida desconocida. Una de las razones principales es la falta de herramientas que puedan mapear la biomecánica del tejido de la placa neural in situ y en tiempo real cuando el embrión se está desarrollando.

Se han desarrollado muchas técnicas importantes para cuantificar las propiedades mecánicas del tejido embrionario13, que pueden clasificarse aproximadamente en tres categorías: (1) técnicas basadas en contacto, incluida la microscopía de fuerza atómica (AFM)14,15 o indentaciones basadas en microcantilever11,16,17 para medir el módulo de Young aparente en escala de nm a µm, aspiración con micropipeta para medir la tensión del tejido en escala de µm18 y prueba de tracción del tejido en escala de ~ mm19. Si bien las técnicas basadas en contacto pueden proporcionar una cuantificación directa de las propiedades viscoelásticas del tejido en condiciones cuasiestáticas o de baja frecuencia, necesitan acceso físico a la muestra y aplicar fuerza para deformar la muestra durante la medición. Dado que el tejido del tubo neural tiene una forma irregular en 3D y está interconectado mecánicamente, normalmente se requieren explantes aislados para pruebas mecánicas inequívocas. (2) Sensores basados ​​en perlas/gotas, incluidas pinzas ópticas/magnéticas20,21 y microgotas22. La pinza óptica/magnética utiliza perlas rígidas impulsadas por fuerza (~ µm de diámetro) para detectar las propiedades reológicas del tejido localizado, y las microgotas utilizan gotitas deformables (4–80 µm de diámetro) para cuantificar la tensión del tejido. Estos sensores pueden medir cuantitativamente las propiedades mecánicas con resolución subcelular o celular después de una cuidadosa calibración. Sin embargo, requieren la inyección de perlas o gotitas en el tejido, lo que los hace invasivos y de bajo rendimiento. (3) Ablación/disección de tejido. Este método utiliza un rayo láser pulsado ultrarrápido10 o una cuchilla23 para diseccionar una porción del tejido y evaluar la tensión del tejido en función de la respuesta de relajación. Esta es una técnica atractiva debido a su sencilla configuración. Sin embargo, debido a la conexión mecánica del tejido embrionario en 3D, este método proporciona principalmente una evaluación global en una escala relativamente grande (~ 100 µm a ~ mm de tamaño). En resumen, los métodos existentes pueden cuantificar diversos aspectos de las propiedades mecánicas de las células y los tejidos con diferentes escalas espaciales y temporales y han avanzado enormemente en la evaluación de la biomecánica del tejido embrionario. Sin embargo, debido a limitaciones técnicas, no se ha informado del mapeo mecánico in situ del tejido de la placa neural durante el procedimiento de NTC en embriones vivos.

La microscopía confocal Brillouin es una técnica emergente para cuantificar las propiedades mecánicas de materiales biológicos24,25,26. A diferencia de los métodos de prueba mecánicos convencionales, la microscopía Brillouin utiliza un rayo láser para medir las propiedades elásticas del material. Esto se basa en un fenómeno óptico llamado dispersión espontánea de la luz de Brillouin27, donde la interacción del rayo láser incidente y el fonón acústico inherente dentro del material introducirá un cambio de frecuencia (es decir, cambio de Brillouin) en la luz dispersada (ver “Métodos”) . Al medir el cambio de Brillouin de la luz dispersada utilizando un espectrómetro personalizado, se puede cuantificar directamente el módulo longitudinal elástico del material. Dado que el microscopio Brillouin está diseñado en una configuración confocal, puede lograr una resolución espacial limitada por difracción. En los últimos años, hemos innovado en esta técnica y demostrado su viabilidad para cuantificar las propiedades mecánicas de células individuales28,29, tejido embrionario30 y placa neural31 con resolución subcelular y suficiente sensibilidad mecánica. Como técnica totalmente óptica, el microscopio Brillouin puede medir la biomecánica sin contacto, de forma no invasiva y sin etiquetas. Por lo tanto, podría ser una herramienta prometedora para mapear las propiedades elásticas del tejido de la placa neural in situ durante el desarrollo embrionario.

En este trabajo, desarrollamos una modalidad óptica que puede realizar imágenes mecánicas de lapso de tiempo de NTC en embriones de pollo. Para ello, integramos un microscopio confocal Brillouin con una incubadora en el escenario para cultivos ex ovo modificados. El cultivo ex ovo garantiza que el embrión se desarrolle continuamente durante 21 h, cubriendo todos los eventos de NTC. En comparación con el cultivo in ovo, donde el embrión se desarrolla dentro de una cáscara de huevo opaca, el cultivo ex ovo proporciona una accesibilidad óptica superior y, por lo tanto, permite imágenes de campo brillante y Brillouin en tiempo real durante el desarrollo del embrión. Luego utilizamos la microscopía Brillouin para adquirir continuamente imágenes mecánicas 2D del tejido de la placa neural craneal mientras el embrión experimentaba la neurulación. Con esta modalidad, observamos un claro aumento en el desplazamiento de Brillouin promedio del tejido de la placa neural durante el NTC del embrión de pollo cultivado ex ovo, lo que es consistente con los resultados del sistema de cultivo in ovo. Es importante destacar que encontramos que el aumento en el módulo tisular en el eje dorsal-ventral estaba fuertemente correlacionado con el engrosamiento de la placa neural así como con el ángulo de cierre, lo que indica que la mecánica del tejido puede sincronizarse con el cambio geométrico de la placa neural para lograr un cierre exitoso del tubo neural. En conjunto, esta modalidad de imágenes mecánicas en lapso de tiempo puede proporcionar nuevos datos para comprender los mecanismos biomecánicos durante la neurulación embrionaria.

Se realizaron imágenes mecánicas 2D con lapso de tiempo en un microscopio Brillouin invertido (Fig. 1a) (ver "Métodos"). Por definición, el cambio de Brillouin está vinculado positivamente al módulo longitudinal mediante las propiedades del material, incluido el índice de refracción \(n\) y la densidad \(\rho\). Para los materiales biológicos, la relación entre el índice de refracción y la densidad \(\rho /{n}^{2}\) es aproximadamente constante durante los procesos fisiológicos24,32. Por lo tanto, aquí utilizamos el cambio de Brillouin para interpretar el cambio relativo del módulo longitudinal. En el cultivo ex ovo modificado, el embrión se colocó en una placa de Petri con el lado dorsal hacia abajo (Fig. 1b). Luego se colocó la placa en la incubadora del escenario para sostener el desarrollo del embrión (> 21 h). Las imágenes de campo brillante con lapso de tiempo sugieren que los embriones del cultivo ex ovo se han desarrollado con un ritmo de tiempo similar al de los del cultivo in ovo (Figuras complementarias S1-S2).

Esquema de la instalación. (a) Microscopio confocal Brillouin con incubadora en escenario. Placa de cuarto de onda QWP, divisor de haz polarizado PBS, acoplador de fibra FC. (b) Plato portador para cultivo ex ovo. La vista lateral (arriba) y la vista superior (abajo) muestran todos los componentes, incluido el embrión, dentro del transportador.

Para excluir cualquier impacto potencial del cultivo ex ovo y la iluminación láser en la mecánica tisular de la placa neural, recolectamos embriones cultivados in ovo (N = 46) en diferentes etapas de Hamburger Hamilton (HH) (HH 6 a HH 12) y Adquirió imágenes mecánicas 2D de la sección transversal perpendicular al eje anteroposterior (cerca de la región craneal). Las imágenes representativas de Brillouin sugieren que la placa neural del embrión en etapas posteriores de HH tiene un cambio de Brillouin mayor que en etapas anteriores (Fig. 2a-d). Luego cuantificamos el desplazamiento promedio de Brillouin de la región de la placa neural en una ubicación similar del eje anteroposterior para todos los embriones recolectados. Observamos que el cambio de Brillouin de la placa neural mostró un claro aumento de HH 6 a HH 9 + y aproximadamente mantuvo su valor después (Fig. 2e). La placa neural del embrión en etapa tardía (es decir, HH 12) tiene un desplazamiento de Brillouin promedio de 6,353 GHz, que es 0,126 GHz mayor que el de los embriones en etapa temprana (es decir, HH 6), lo que corresponde a un aumento de ~ 60% de la de Young. módulo de acuerdo con la relación empírica entre el módulo longitudinal y el módulo de Young obtenido de las células28 (ver “Métodos”).

Resultados de embriones cultivados in ovo. (a – d) Imágenes representativas de Brillouin del tejido del tubo neural craneal de cuatro embriones en diferentes etapas de HH: (a) HH 6, (b) HH 8, (c) HH 11, (d) HH 12. La línea discontinua roja delinea el Región de la placa neural. (e) Los cambios promedio de Brillouin de la placa neural craneal de los embriones revelan un aumento continuo en el módulo del tejido frente a la etapa de desarrollo. Número de embriones: 46. Cada punto representa el cambio Brillouin promedio de un embrión. La barra de escala es de 50 µm.

Para capturar la evolución mecánica de la placa neural durante todo el procedimiento de NTC, realizamos un mapeo mecánico en lapso de tiempo de embriones cultivados ex ovo. El embrión se cultivó continuamente durante más de 14 h (Figura complementaria S3), dentro de las cuales se adquirió la imagen de Brillouin en lapso de tiempo de la sección transversal de la placa neural en la región cervical/rompecéfalo (Figura 3a) en el tercer par de somitas. a lo largo de la placa neural en desarrollo (Figura complementaria S3). Los resultados muestran que el cambio de Brillouin promedio de la placa neural aumenta continuamente con el tiempo de cultivo (Fig. 3b), lo que es consistente con el resultado de embriones cultivados in ovo. Los experimentos repetidos (N = 9) sugieren que el aumento en el cambio de Brillouin de la placa neural durante el NTC es un fenómeno común en los embriones de pollo (Fig. 3d). Específicamente, el desplazamiento de Brillouin de la placa neural aumentó significativamente de HH 8- a HH 9 y tuvo cambios menores después. En el punto final del cultivo ex ovo (HH 10), las placas neurales tienen un desplazamiento de Brillouin promedio de 6,336 GHz, que es 0,097 GHz mayor que el de la etapa más temprana (HH 8-), lo que corresponde a un aumento relativo de ~ 46 %. en términos del módulo de Young. Esto es consistente con el resultado de embriones cultivados in ovo, lo que confirma que el cultivo ex ovo y la iluminación láser no afectaron la evolución mecánica del tejido de la placa neural durante el desarrollo embrionario.

Imágenes Brillouin en lapso de tiempo de embriones cultivados ex ovo. ( a ) Imágenes de Brillouin en lapso de tiempo de un embrión representativo durante 14 h. (b) El desplazamiento de Brillouin promedio del tejido de la placa neural del embrión en (a) aumenta con el tiempo de cultivo. (c) El grosor del tejido de la placa neural del embrión en (a) aumenta con el tiempo de cultivo. (d) Se observa un aumento en el cambio de Brillouin en función de la etapa de desarrollo en todos los embriones (N = 9). (e) Se observa engrosamiento del tejido en comparación con la etapa de desarrollo de todos los embriones. (f) Correlación entre el cambio promedio de Brillouin y el espesor del tejido de la placa neural. Los símbolos representan diferentes embriones. Número de mediciones: 39. La prueba t de dos muestras se utiliza para cuantificar la significación estadística. *p = 0,008; **p = 0,012; ***p = 0,049; ****p = 0,01. La barra de escala es de 50 µm.

Utilizando la mecánica tisular como mecanismo de contraste en las imágenes de Brillouin, también podemos cuantificar los cambios morfológicos de la placa neural durante el NTC. Aquí, medimos el grosor promedio de los dos sitios, que es la mitad de la distancia entre el punto de articulación mediano y las puntas neurales (Fig. 3c). De acuerdo con la literatura publicada2,33, observamos un engrosamiento cuatro veces mayor de la placa neural desde HH 8- (~ 13 µm) hasta HH 9 (~ 52 µm) (Fig. 3e). Curiosamente, encontramos que el engrosamiento del tejido y el aumento del módulo del tejido exhiben tendencias muy similares durante el procedimiento de NTC. Luego trazamos el cambio de Brillouin frente al espesor de todos los embriones cultivados ex ovo y encontramos una fuerte correlación (\(p<1\times {10}^{-6}\)) entre el aumento del cambio de Brillouin y el engrosamiento del tejido. (Figura 3f). Estos datos sugieren que el aumento en el módulo longitudinal del tejido y el engrosamiento del tejido probablemente sean eventos coordinados temporalmente durante el NTC.

NTC es un proceso biomecánico complejo de configuración y modelado de tejidos impulsado por la fuerza y ​​las propiedades mecánicas del tejido. Por tanto, es fundamentalmente necesario comprender la relación entre la mecánica y la geometría de los tejidos. Aquí, observamos empíricamente cómo el aumento en el módulo del tejido se coordina con el cambio geométrico de la placa neural. Según las imágenes de Brillouin, definimos el ángulo de cierre \(\beta\) como la intersección de los lados izquierdo y derecho de la placa neural en el punto de articulación mediano (Fig. 4a). Según la definición, \(\beta =180^\circ\) y 0° representan que la placa neural es plana y completamente cerrada, respectivamente. A continuación, distribuimos embriones cultivados ex ovo (etapas de desarrollo entre HH8 y HH10) en cada intervalo de 10º y calculamos los valores promediados para cualquier intervalo que tenga múltiples embriones. Luego trazamos el desplazamiento de Brillouin \({\omega }_{B}\) contra el ángulo de cierre \(\beta\) (Fig. 4b). Los datos se pueden ajustar bien mediante una curva empírica simple \({\omega }_{B}=A\cdot \mathrm{exp}\left(B\cdot \beta \right)+C\), con parámetros ajustados \ (A=-0.024, B=7.85\times {10}^{-3},\) \(C=6.348\), y el coeficiente de ajuste \({R}^{2}=0.67\). Esta correlación positiva sugiere que el aumento del módulo tisular probablemente esté sincronizado con la flexión de la placa neural durante el procedimiento de NTC. Tenga en cuenta que este análisis no consideró los embriones anteriores a HH 8 o posteriores a HH 10, en cuyas etapas la mecánica del tejido podría ser diferente para el mismo ángulo de cierre (180° o 0°). Dado que el microscopio Brillouin tiene una configuración confocal, el ángulo de dispersión no se verá afectado por la flexión de la placa neural; por lo tanto, excluimos los posibles artefactos introducidos por la flexión del tejido debido al aumento observado en el cambio de Brillouin. Se necesita más investigación para comprender el mecanismo biológico subyacente que coordina el aumento del módulo y la flexión del tejido.

El aumento de Brillouin Shift se correlaciona con la flexión del tejido en embriones cultivados ex ovo. (a) Definición del ángulo de cierre. (b) El ángulo de cierre se correlaciona con el desplazamiento de Brillouin promedio de la placa neural. Se recopilan datos de embriones en etapas de desarrollo de HH 8- a HH 10. \(\beta =180^\circ\) y 0° representan que la placa neural es plana y completamente cerrada, respectivamente. Los embriones se distribuyen en cada intervalo de 10° según el ángulo de cierre. El punto de datos representa el valor promedio de los embriones dentro del mismo intervalo. La barra de error representa la desviación estándar. La curva sólida es el resultado adecuado de una función empírica.

Aquí, desarrollamos una modalidad óptica para el mapeo mecánico en intervalos de tiempo de embriones de pollo vivos. Esta modalidad se basa en la combinación de un microscopio confocal Brillouin y un sistema de cultivo ex ovo modificado, que tiene resolución subcelular y suficiente sensibilidad mecánica. A diferencia de las técnicas convencionales para pruebas mecánicas, nuestro método utilizó un rayo láser enfocado para cuantificar la mecánica del tejido, lo que lo hace sin contacto, no invasivo y sin etiquetas. Confirmamos que el cultivo ex ovo y la iluminación láser no perturbaron el desarrollo del embrión. Demostramos la viabilidad de esta técnica mediante la adquisición de imágenes mecánicas 2D de la placa neural in situ mientras el embrión experimentaba la neurulación. Descubrimos que el tejido de la placa neural experimentó un aumento continuo en el módulo del tejido durante el NTC. Anteriormente se ha informado en otras especies de rigidez del tejido durante la neurulación. Por ejemplo, el módulo elástico del neuroepitelio de los embriones de ajolote aumentó una vez desde la etapa 13 hasta la etapa 1519. Además, se ha observado que el tejido neural dorsal en el embrión temprano de Xenopus aumenta casi 4 veces desde la etapa 11.5 hasta la etapa 2111. Recientemente , los estudios preliminares en embriones de ratón sugieren un aumento de hasta el 80% en el módulo tisular durante la neurulación mediante microscopía de Brillouin31,34. Aunque estos datos no son directamente comparables con este trabajo debido a las diferencias en las especies y/o las técnicas utilizadas, la tendencia similar observada en embriones de pollo sugiere que la biomecánica de los tejidos puede desempeñar un papel importante durante el NTC en todas las especies. El aumento en el módulo tisular probablemente sea causado por el aumento de la densidad celular y/o la acumulación de contractilidad de actomiosina10,11,15, lo que debería investigarse en trabajos futuros. Más allá de eso, observamos que el aumento en el módulo del tejido está fuertemente correlacionado con el engrosamiento y la flexión del tejido.

La neurulación es un proceso complejo que involucra actividades celulares, moleculares y biomecánicas9,36. Si bien la regulación genética y la señalización bioquímica se han investigado ampliamente, el mecanismo biomecánico está menos explorado y el vínculo subyacente entre las actividades celulares/moleculares microscópicas y la morfogénesis macroscópica se desconoce en gran medida5. Dado que nuestra técnica totalmente óptica puede cuantificar directamente la mecánica del tejido 2D/3D dentro de embriones vivos intactos, potencialmente puede abrir nuevas oportunidades para comprender mejor el papel de los mecanismos biomecánicos en el procedimiento de NTC. Por ejemplo, un par de actividades celulares cruciales, incluida la extensión convergente 37, la constricción apical 38 y la migración nuclear intercinética 39,40, pueden coordinar juntas el aumento observado en el desplazamiento, el engrosamiento y la flexión de Brillouin. La resolución subcelular del microscopio Brillouin permitirá a los investigadores investigar más a fondo el papel de estos comportamientos celulares en la regulación de la biomecánica de los tejidos. Por otro lado, las señales mecánicas pueden guiar el comportamiento y el destino de las células mediante la mecanotransducción durante el desarrollo embrionario36,41; por tanto, la técnica puede ayudar a comprender la interacción entre la señalización bioquímica y las señales biomecánicas. Además, el cierre del tubo neural está impulsado físicamente tanto por la fuerza generada como por la resistencia mecánica del tejido10,12,42. La cuantificación in situ de las propiedades mecánicas puede ayudar a desacoplar las funciones de la fuerza y ​​la mecánica del tejido y así permitir una mejor dilucidación de las interacciones biomecánicas. Además, el modelado computacional es una herramienta poderosa para comprender el mecanismo de morfogénesis43,44,45. Las imágenes mecánicas en intervalos de tiempo del tejido de la placa neural adquiridas mediante nuestra técnica pueden proporcionar nuevos datos de entrada para la simulación de la neurulación.

Los defectos del tubo neural (DTN) se encuentran entre las enfermedades congénitas humanas más comunes y están regulados tanto por factores genéticos como ambientales46,47. A nivel tisular, los DTN surgen del fallo físico del tubo neural debido a la interacción anormal entre la generación de fuerza y ​​las propiedades mecánicas del tejido embrionario. Trabajos recientes sugieren que el NTD inducido por mutación genética está asociado con una biomecánica tisular alterada10. Por lo tanto, una herramienta cuantitativa para medir la mecánica de los tejidos debería permitir a los investigadores atribuir diferentes NTD a desregulaciones específicas de los mecanismos celulares que causan el fallo del cierre del tejido, lo que podría cerrar la brecha entre los factores genéticos/ambientales y la biomecánica del tejido y ayudar a prevenir la enfermedades.

Vale la pena señalar que, por definición, el módulo longitudinal de alta frecuencia medido por la técnica de Brillouin es diferente del módulo de Young de baja frecuencia o cuasiestático medido por métodos convencionales como el AFM. Sin embargo, para muchos materiales biológicos, se ha descubierto que los dos módulos cambian en la misma dirección en respuesta a actividades biológicas48,49. Por lo tanto, con una calibración cuidadosa para materiales específicos, se podrían interpretar los datos de Brillouin en términos del módulo de Young. En este trabajo, utilizamos el desplazamiento de Brillouin para estimar el cambio relativo del módulo del tejido asumiendo que la relación entre densidad y índice de refracción (\(\rho /{n}^{2}\)) es constante. Para cuantificar directamente el módulo derivado de Brillouin, la microscopía de Brillouin se puede combinar con otras técnicas que pueden medir la densidad y/o el índice de refracción50. A medida que aumenta la profundidad de la imagen, la intensidad de la señal de Brillouin disminuirá dependiendo de la transparencia del tejido. Para embriones de pollo, la profundidad máxima de penetración de nuestro instrumento es de aproximadamente 200 µm. Se pueden lograr mejoras adicionales utilizando una fuente láser con una longitud de onda más larga o una técnica de corrección del frente de onda basada en óptica adaptativa51. El desplazamiento de Brillouin inferior observado en el límite de la placa neural en las Figs. 2 y 3 es probablemente un artefacto del experimento. En la configuración confocal, el desplazamiento de Brillouin en cada píxel es el promedio de todas las señales de Brillouin del punto del haz enfocado (vóxel). En el límite de la placa neural, dado que el punto del haz está parcialmente lleno con medio circundante y/o mesodermo que tiene un cambio de Brillouin más bajo, el efecto promedio provocará una disminución del cambio de Brillouin final. Este efecto se puede mitigar mediante el uso de una lente de objetivo de NA alta junto con el posprocesamiento de datos35.

Los huevos de Leghorn blancos fertilizados se compraron en una granja avícola de la Universidad de Connecticut. Para el cultivo in ovo, los huevos se incubaron a 37 °C con alta humedad. Las horas de incubación siguen la estadificación de Hamburger-Hamilton (HH) (es decir, 26 a 29 h de incubación para obtener el embrión HH-4)52. Todos los experimentos realizados en este estudio cumplieron con las directrices y regulaciones pertinentes, y los protocolos experimentales fueron aprobados por la oficina de Bioseguridad de la Universidad de Maryland. En este estudio no se utilizaron vertebrados vivos.

El protocolo de cultivo ex ovo se derivó de Chapman et al. y Schmitz et al.53,54 con modificaciones para adaptarse al microscopio Brillouin. Para el cultivo ex ovo se utilizó una placa con fondo de vidrio de 35 mm con un micropocillo de 20 mm (Cellvis, D35-20-0-N). Se cubrió un anillo metálico de 1 pulgada (Thorlabs, SM1RR) con un Parafilm de una sola capa y se cortó un orificio elíptico de 1 cm en el centro y se colocó sobre el micropocillo (pocillo inferior interior del plato). Para realizar el cultivo ex ovo, utilizamos el método de soporte de papel de filtro para mantener el blastodermo y la membrana vitelina bajo tensión para imitar la situación del cultivo in ovo. El embrión precultivado alrededor de HH 4 se recogió del huevo y luego se colocó con el lado dorsal hacia abajo en un plato de cultivo lleno de albúmina fina extraída del huevo (medio de cultivo). A continuación, la placa se colocó en una incubadora en escena (Warner Instruments, SA-20PLIXR-AL) para cultivo continuo. Para garantizar que la temperatura ambiente del embrión sea de aproximadamente 37 °C, el calentador (Warner Instruments, TC-344C) de la incubadora en estado encendido se ajustó a 39 ± 0,2 °C considerando la disipación de calor desde la parte inferior de la etapa, que es abierto a la lente del objetivo.

La dispersión espontánea de la luz Brillouin son las interacciones entre la luz incidente y los fonones acústicos inherentes dentro de una muestra. El resultado de esta interacción introduce un cambio de frecuencia (desplazamiento de Brillouin) en la luz dispersada saliente. El desplazamiento de Brillouin \({\omega }_{B}\) se define como \({\omega }_{B}=2n/\lambda \cdot \sqrt{{M}^{^{\prime}}/ \rho }\cdot \mathrm{sin}(\theta /2)\), donde \(n\) es el índice de refracción del material, \(\lambda\) es la longitud de onda del láser, \({M}^{ ^{\prime}}\) es el módulo longitudinal que cuantifica las propiedades mecánicas, \(\rho\) es la densidad y θ es el ángulo de recogida de la luz dispersada. En nuestro microscopio Brillouin, se recolectó luz dispersada hacia atrás, lo que produjo \(\theta =180^\circ\).

Para materiales biológicos, se ha establecido una relación empírica entre el módulo de Young \(E\) y el módulo longitudinal derivado de Brillouin \({M}^{^{\prime}}\): \(\mathrm{log}\left( {M}^{^{\prime}}\right)=a\cdot \mathrm{log}\left(E\right)+b\), donde los parámetros \(a\) y \(b\) son dependiente del material24. Considerando la relación entre \({M}^{^{\prime}}\) y el desplazamiento de Brillouin \({\omega }_{B}\), el cambio relativo del desplazamiento de Brillouin está relacionado con el del módulo de Young por \ (\Delta E/E=2/a\cdot \Delta {\omega }_{B}/{\omega }_{B}\). Para las celdas, la calibración contra AFM muestra \(a=0.0671\). Aquí utilizamos esta relación calibrada para estimar el cambio relativo del módulo de Young.

Para todos los experimentos se utilizó un microscopio confocal Brillouin. El detalle de la instrumentación se puede encontrar en nuestro reciente informe25. Brevemente, se utilizó como fuente de luz un láser de onda continua monomodo de 660 nm con una potencia de ~ 30 mW. El rayo láser se enfocó en la muestra mediante una lente objetivo (Olympus, 40 × /0,6 NA) instalada en un microscopio invertido (Olympus, IX81), que produce un tamaño de punto de 0,7 μm × 0,7 μm × 2,6 μm. La señal de Brillouin dispersada hacia atrás fue recolectada por el mismo objetivo y analizada por un espectrómetro basado en VIPA (Light Machinery, 15 GHz FSR) de dos etapas, y el espectro de Brillouin fue registrado por una cámara EMCCD (Andor, iXon 897) con un tiempo de exposición. de 0,05 s. Las imágenes 2D Brillouin se adquirieron escaneando la muestra utilizando un escenario motorizado (tamaño de paso: 0,5 µm). La sección transversal perpendicular al eje anteroposterior del cuerpo se mapeó mediante un microscopio Brillouin y se utilizó el desplazamiento Brillouin promediado de la región de la placa neural para representar las propiedades mecánicas del tejido. El único contraste de una imagen Brillouin proviene de la diferencia en el desplazamiento de píxeles de Brillouin. El cambio de Brillouin del medio de cultivo de albúmina delgada es muy cercano al de la placa neural para embriones en etapa temprana, lo que dificulta identificar el límite del tejido de la placa neural en la imagen de Brillouin. Para resolver este problema, justo antes de adquirir cada imagen de Brillouin, el embrión se transfirió temporalmente a una placa de cultivo diferente llena con solución de Ringer (Thermo Scientific, BR0052G), que tiene un desplazamiento de Brillouin mucho menor y, por lo tanto, proporciona un buen contraste. Tan pronto como se realizó la medición de Brillouin, el embrión se transfirió nuevamente a un medio de cultivo de albúmina fino para un desarrollo continuo. Para adquirir las imágenes de campo brillante, se utilizaron un objetivo de bajo aumento (Olympus, 4x/0,1) y una cámara CMOS (Andor Neo) cuando el embrión estaba en la placa de cultivo ex ovo.

Se utilizó un programa de adquisición LabView (National Instruments, versión 2021) de fabricación propia para adquirir imágenes de campo brillante y espectros Brillouin. Para la calibración del espectrómetro, se registraron espectros Brillouin de materiales (agua y metanol) con cambios de Brillouin conocidos y se utilizaron para calcular el rango espectral libre y la relación convención de píxeles a frecuencia. El desplazamiento de Brillouin de cada píxel se obtuvo ajustando el espectro de Brillouin a una función de Lorentz usando MATLAB (MathWorks, R2021b). Las imágenes 2D de Brillouin se reconstruyeron a partir del vector de píxeles. El tamaño de la muestra se eligió en función de la experiencia previa y fue razonablemente grande para demostrar la viabilidad de la técnica.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y en sus archivos de información complementaria.

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Jitao Zhang

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JZ concibió el proyecto. CH, JZ y GS idearon el plan de investigación. CH realizó los experimentos. Todos los autores discutieron los datos. JZ y CH escribieron el manuscrito con aportaciones de todos los demás autores.

Correspondencia a Jitao Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Handler, C., Scarcelli, G. & Zhang, J. Imágenes mecánicas de lapso de tiempo del cierre del tubo neural en embriones vivos mediante microscopía Brillouin. Representante científico 13, 263 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27456-z

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Recibido: 13 de octubre de 2022

Aceptado: 02 de enero de 2023

Publicado: 06 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27456-z

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